Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Published: April 30, 2021 doi: 10.3791/61895
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 3,4, 1
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

Summary

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

Abstract

Karmaşık hastalık modelleri, fizyolojik ve patolojik olarak alakalı, eyleme geçirilebilir içgörüler sunabilen ve aksi takdirde görünmez süreçleri ortaya çıkarabilen son teknoloji araçlar gerektirir. İn vivo manzarayı yakından taklit eden gelişmiş hücre tahlilleri, kanserin ilerlemesini etkileyen çift yönlü tümör-konakçı etkileşimini görselleştirmek ve ölçmek için yeni yollar olarak kendilerini ortaya koymaktadır. Burada, doğal ve terapiye bağlı immünosürveyans altında, tümör mikroçevresinin (TME) karmaşıklığını taklit ederek, mikrocihazlarda yüksek oranda kontrol edilebilir 2D ve 3D ko-kültürleri yeniden oluşturmak için iki çok yönlü protokolü açıklıyoruz. Bölüm 1'de, yapışkan tümör hücreleri ile yüzen bağışıklık popülasyonları arasındaki çapraz etkileşimi, parlak alan hızlandırılmış mikroskopi ile izlemek için deneysel bir ortam sağlanmıştır. Uygulamalı bir senaryo olarak, immünojenik kanser hücresi ölüm indükleyicileri olarak adlandırılan anti-kanser tedavilerinin bağışıklık hücrelerinin işe alınması ve aktivasyonu üzerindeki etkilerini analiz ediyoruz. Bölüm 2'de, 3D tümör immün mikro ortamlar rekabetçi bir düzende monte edilmiştir. Diferansiyel immün infiltrasyon, kombinasyon terapötik stratejilerini değerlendirmek için 72 saate kadar floresan anlık görüntüleri ile izlenir. Her iki ortamda da, görüntü işleme adımları, çok sayıda bağışıklık hücresi parametresini (örneğin, bağışıklık hücresi göçü ve etkileşimi, terapötik ajanlara yanıt) çıkarmak için gösterilmiştir. Bu basit ve güçlü yöntemler, kanser, stromal ve immün hücre alt tiplerinin heterojenliğini ve plastisitesini kapsayan TME'nin karmaşıklığını ve ayrıca kanser evriminin itici güçleri olarak karşılıklı etkileşimlerini simüle etmek için daha da uyarlanabilir. Hızla gelişen bu teknolojilerin canlı hücreli yüksek içerikli görüntüleme ile uyumluluğu, büyük bilgilendirici veri kümelerinin oluşturulmasına yol açarak yeni zorluklar ortaya çıkarabilir. Gerçekten de, "ortak kültürler / mikroskopi / gelişmiş veri analizi" üçgeni, özel olarak hazırlanmış terapötik protokollere yardımcı olabilecek kesin bir problem parametrizasyonuna giden yolu belirler. Yüksek verimli işleme için kansere karşı bağışıklık kazanmış çip üzerindeki yapay zeka ile gelecekteki entegrasyonunun, hassas ve kişiselleştirilmiş onkoloji için öngörücü ve klinik öncesi araçlar olarak yeteneklerden yararlanmada ileriye doğru büyük bir adım atmasını bekliyoruz.

Introduction

Farklı tıp dallarının deneysel disiplinler olarak evrimi, kontrollü koşullar altında hücre popülasyonunu ve organ fonksiyonlarını manipüle etme yeteneğine bağlı olmuştur1. Bu yeteneğin kökleri, vücudumuzda meydana gelen süreçleri özetleyebilen ölçülebilir modellerin mevcudiyetinde yatmaktadır.

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme 2 çağında, kanser biyolojisinin, tümör-immün arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için ortaya çıkan in vitro ve hesaplamalı modellerden yararlanması gerekir 2,3.

Tümör mikroçevre4 (TME), kanser hücrelerinin diğer hücresel (immün, stromal ve endotel hücreleri) ve hücresel olmayan (hücre dışı matriks, ECM) bileşenlerle sürekli etkileşime girdiği ve dinamik olarak birlikte evrimleştiği karmaşık bir dokudur. Bu karmaşık manzaranın dinamik doğası, bağışıklık hücrelerinin kötü huylu hücrelerin arkadaşları veya düşmanları olarak oynayıp oynamadığını belirler, böylece hem hastalığın ilerlemesini hem de tedaviye yanıtı güçlü bir şekilde etkiler. Günümüzde, onko-immünologların, biyoinformatikçilerin ve sistem biyolojisi uzmanlarının büyük çabaları, kanser heterojenliğinin klinik önemini ele almak için bir araya gelmektedir 5,6, ya uzayda (yani farklı tümör bölgelerinde) ve zamanda (yani, farklı tümör progresyon aşamalarında)5,6 ve kanseri ve bağışıklık hücresi fenotipini ve işlevini tek hücre düzeyinde karakterize etmek. Bu sinerjinin bir örneği olarak, histolojik örneklerde immün infiltrasyonun mekansal haritalanması için gelişmiş bilgisayar-görme teknikleri artık rutin olarak kullanılmaktadır 7,8.

Deneysel modellerin önünde, hayvan çalışmaları ve geleneksel in vitro yöntemler arasında köprü kuran mikroakışkanlar ve birlikte kültürleme tekniklerindeki ilerlemeler, organoidler, mikro-fizyolojik sistemler 9,10,11 (MPS) ve çip üzerinde organlar 12,13,14 gibi farklı mikro mühendislik ürünü hücresel model sınıflarına erişim sağlamaktadır (OOC). Hücresel ekosistemlerin 'büyük resim' görünümünü yakınlaştırmak ve yüksek içerikli mikroskopi15 ve görüntü işleme yaklaşımlarından yararlanırken mikroçevresel faktörleri kontrol etmek için in vitro potansiyeli genişletmek için ortak özelliği paylaşıyorlar.

Günümüzde, son teknoloji ürünü MPS ve OOC sistemleri, enflamatuar hastalıklar, yara iyileşmesi, mukozal bağışıklık ve toksinlere veya günlük gıda ürünlerine yanıt gibi çeşitli süreçleri araştırmak ve ölçmek amacıyla, mevcut dokulara ve ortak kültürlere farklı bağışıklık hücreleri alt tiplerini dahil eden immünolojik yönleri içermeye başlamıştır16. 18,19,20,21 eriyebilir mikrodamarlarla da entegre olan 10,11,12,13,14,15,16,17 TME-on-a-chip modelleri, hücre tipine bağlı etkileşimleri, fiziksel ve kimyasal bozulmaları ve sitotoksik aktivitesini araştırmak için geliştirilmiştir. infiltrasyon lenfositleri22 ve klinik olarak ilgili immünomodülatör ajanlar23.

Burada, hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik24 izlenmesi ve görselleştirilmesi ile uyumlu, 2D (bölüm 1) ve 3D (bölüm 2) ayar16'daki gelişmiş tümör immün mikroakışkan ko-kültürlerinden yararlanmak için çiplerdeki hücrelerin yüklenmesinden görüntü işleme araçlarına kadar uzanan çok yönlü protokoller sunuyoruz. Bu, hem numune yönetiminde hem de veri analizinde kullanım kolaylığını ve esnekliği koruyarak, Fiji ücretsiz yazılımından ve araç kutularından yararlanarak elde edilir25,26.

Bölüm 1'de açıklanan mikroakışkan cihaz, yapışkan kanser ve yüzen bağışıklık hücrelerinin 2D ortak kültürlerini gerçekleştirmek için tasarlanmıştır. Bu platform, genetik mutasyonlar27 ve / veya immün yetmezlikler28 varlığında immün hücre davranışının in vitro ölçümü için doğrulanmıştır. Burada, Trackmate'e (Fiji yazılımında uygulanan bir eklenti) dayanan yarı otomatik bir yöntemden yararlanarak, hızlandırılmış parlak alan görüntülerinde bağışıklık hücrelerini izleme adımlarını gösteriyoruz. Bu prosedür, immünojenik hücre ölümü indükleyicileri27 ile tedavi edilen veya edilmeyen kanser hücrelerini hedeflemek için immün migrasyon 29'un kinematik tanımlayıcılarının ve yanıtının (yani, etkileşim sürelerinin) ekstraksiyonunu sağlar.

Daha da önemlisi, zaman serisi görüntülerinden çıkarılan bu parametreler, gelişmiş matematiksel makinelerle işlenebilir. Bu yaklaşımın potansiyelinin bir örneği olarak, gruplarımız yakın zamanda hücresel ağ özelliklerini modellemek ve bağışıklık hücresi davranışının parametrik bir tanımını sağlamak için stokastik süreçlerden ve istatistiksel mekanikten matematiksel yöntemlere dayanan bir analiz yayınladı (yani, önyargılı veya ilişkisiz rastgele yürüyüş, yüksek veya koordineli olmayan hareket30,31).

İkinci bölümde sağlanan 3D ayarı, farklı hücre tipleri ve ilaç kombinasyonları ile iki jel bölgesine gömülü daha karmaşık immünokompetan TME'leri rekabetçi bir şekilde yeniden oluşturmak için bir ko-kültür protokolüne dayanmaktadır. Burada, antitümör ajan kombinasyonlarını değerlendirmek için Matrigel içinde yetiştirilen insan A375M melanom hücrelerinde lekeli bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu farklı zaman noktalarında ölçmek için görüntü işleme adımları açıklanmaktadır32. Yüksek metastatik fenotiple karakterize bir A375P türevi hücre hattı olan A375M hattı, immün hücrelerin varlığında metastatik yeteneklerini değerlendirmek için seçildi32.

Açıklanan modeller farklı hücre kaynaklarıyla (murin ve insan ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücre hatları, organoidler, ksenogreftler, diğerleri arasında) tamamen uyumlu olabilir. Laboratuvarımızın son çalışmalarında, yüksek içerikli video mikroskopisini görüntü analizi ile birleştirerek, aşağıdakileri araştırmak için rekabetçi 3D düzeni uygulanmıştır: i) bir anti-tümöral (antikor bağımlı hücre aracılı sitotoksisite, ADCC) immün yanıt ve fibroblastların HER2 + meme kanseri çip üstü modellerinde trastuzumab tedavisine dirençteki rolünü incelemek33; ii) Miyeloid hücrelerin (yani, kanserle ilişkili makrofajların) tümör kaçırma ve T hücrelerinin işe alım mekanizmalarındaki etkisi34; iii) Kollajen matrislerinde ilaçla tedavi edilen kolon kanseri hücreleri ile yetiştirilen, özellikle interferon α şartlandırılmış dendritik hücrelere (IFN-DC'ler) dayanan immünoterapötik rejimlerin etkinliği ve etkili hareketi ve bunu takip eden fagositoz olaylarını değerlendirmek35; iv) kemik iliği kaynaklı eozinofillerin IL-33 ile tedavi edilmiş veya tedavi edilmemiş melanom hücrelerine kemotaktik göçü36.

Bu gelişmiş modeller, immün konstaksiyonun kanser metastazı ve direnç mekanizmalarındaki rolünü anlamak için gözlem pencereleri olarak hizmet edebilir, ancak bulguları kliniklere çevirmek ve temel araştırmalarla boşluğu kapatmak için çaba sarf etmek gerekir37.

Ortaya çıkan bir senaryo olarak, otomatik yüksek içerikli mikroskopinin gücünden yararlanmak, fizyolojik olarak daha alakalı mikrosistemlerin kullanımıyla birleştiğinde, tek bir deneysel kampanyadan üretilebilecek yüzlerce, hatta binlerce Gigabayt multiparametrik verinin işlenmesi, işlenmesi ve yorumlanması için yeni potansiyel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu, OOC deneylerinin yapay zeka 38,39,40,41,42 (AI) tabanlı algoritmalarla doğrudan bir bağlantısı anlamına gelir, hem gelişmiş otomatik analiz hem de kanser-bağışıklık etkileşiminin siliko modellerinde sırayla beslenebilecek özelliklerin üretilmesi43, ufukta öngörücü ilaç tarama tahlillerinin geliştirilmesi gibi heyecan verici yeni uygulamalarla44.

Sürekli genişleyen bir çaba akışı, tek hücreli çoklu omik okumalarla büyük ölçekli pertürbasyon ekranlarını uygulamak için stratejilerin optimizasyonu ile birlikte hastalık modellerinin tasarımına odaklanmıştır. Bu şüphesiz, bağışıklık bozuklukları ve kanser yayılma mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmek için sistematik bir onko-immünoloji-on-a-chip yaklaşımının uygun bir yöntem standardizasyonu derecesi ile birlikte geliştirilmesine ve umarım klinik olarak uygulanmasına yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yapışkan ve yüzen hücreler için çip tasarımı 2D ortak kültürler

NOT: 2B ortak kültür düzeni (Şekil 1A-C), iki mikrokanal dizisi seti (500 x 12 x 10 μm3, L×G×H) ile birbirine bağlanmış üç odacıkla (100 μm yüksekliğinde) karakterize edilir. Ara oda, yükleme adımı 2.5 sırasında tümör bölgesine taşan yüzen bağışıklık hücrelerini bloke eden iki kapalı çıkmaz bölme oluşturur. Bu cihaz tipi, tek hücreli (yapışkan veya yüzen) hareketliliğin ve hücre-hücre etkileşimlerinin 16,27,28,30,31 gerçek zamanlı çift boyutlu ölçümleri için kullanışlıdır. Tipik bir hücre göçü çalışması (birkaç saatten birkaç güne kadar yürütülen), elde edilen görüntü dizilerini sayısal özelliklere çevirmek için canlı hücre mikroskopisini görüntü işleme algoritmaları45 ile birleştirir25. Göç modellerine dayanarak, hücrelerin yer değiştirmesi ve hızının yanı sıra bağışıklık hücresi süresi ve hedef hücre etkileşimleri gibi çeşitli biyofiziksel göstergeler tahmin edilebilir24.

  1. Kanser ve PBMC hücrelerinin hazırlanması
    1. Kanser hücre kültürü
      NOT: MDA-MB-231 üçlü negatif [östrojen reseptörü (ER)-, progesteron reseptörü (PR)- ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2)-] insan meme adenokarsinomu hücreleri,% 10 (v / v) fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IU mL−1 penisilin G sodyum tuzu ve 100 μg mL−1 streptomisin sülfat (büyüme ortamı) ile desteklenmiş bir Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamında rutin olarak yetiştirilir, standart kültür koşullarında (37 °C ve% 5 CO2).
      1. Hücre kültürü büyümesini optimize etmek için, 12-15 mL büyüme ortamında 1 × 106 hücre mL-1 yoğunluğunda 75cm2 şişe içinde MDA-MB-231 hücrelerini plakalayın.
      2. Hücreler birleşmenin% 75-80'ine ulaştığında, büyüme ortamını atın, FBS'yi tamamen çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve daha sonra önceden ısıtılmış tripsin ile ayırın (37 ° C'de 1-2 dakika).
      3. Tripsin enzimatik aktivitesini inaktive etmek ve ayrılmış hücreleri toplamak için büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 1.100 x g'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
      4. Trypan Blue boya dışlama testi ile bir hücre sayım slayındaki hücreleri sayın ve daha sonra bakım kültürü (çözülmeden en fazla 6 pasaj için) veya deneysel prosedürler için bunları yeniden tohumlayın.
      5. Mikroakışkan deneyler için, tohum 1 × 106 hücre, 3 mL büyüme ortamında 6 delikli plakalarda bulunur ve kontrol olarak 25 μM doksorubisin (DOXO) veya eşit miktarda DOXO çözücü (PBS) ile muamele edilir.
      6. Dört ila 6 saat sonra, DOXO ile muamele edilmiş hücreleri RT'de 1.100 x g'de 5 dakika boyunca önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın.
      7. DOXO ile tedavi edilen ve PBS ile tedavi edilen kontrol hücrelerini yukarıdaki gibi sayın (bkz. adım 1.1.1.5) ve mikroakışkan cihazlarda periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ile ortak kültürü ayarlayın.
    2. PBMC yalıtımı
      1. Heparinize şişelerde sağlıklı gönüllülerden venöz tam kan (yaklaşık 10 mL) toplayın ve tüpü 2-4 kez47 ters çevirerek hafifçe karıştırın.
      2. PBS ile kan 1: 1 oranında seyreltin ve 50 mL'lik bir tüpte 10 mL yoğunluk gradyanı ortamı Lenfoprep tabakası üzerinde tabaka oluşturun.
        NOT: Kan ve Lenfoprep'in iki ayrı katman oluşturmasına izin vermek için katmanlamayı çok yumuşak ve yavaş yaptığınızdan emin olun.
      3. Santrifüj tüpleri, frensiz bir salınımlı kovada 4 ° C'de 400 x g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Dört ayrı katman oluşacaktır: (i) üstte plazma, (ii) PBMC'ler içeren beyaz ve bulutlu bir tabaka, (iii) Lenfoprep ve (iv) eritrositler ve granülositlerden oluşan bir pelet.
      4. PBMC'leri 2 mL'lik bir pipetle nazikçe aspire edin ve ılık büyüme ortamında (1.1.1. adımda kullanılanla aynı) hemen askıya alın ve RT'de 1.100 x g'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
      5. Peletlenmiş PBMC'leri yukarıdaki gibi sayın (bkz. adım 1.1.1.5) ve deneysel prosedürler için kullanın veya uzun süreli depolama için dondurun.
  2. Hücrelerin 2D çiplerle kaplanması
    NOT: PBMC'ler bu protokolde lekeli değildir. Çip üzerindeki spesifik fenotipleri karakterize etmek için, immün hücre alt popülasyonları immünomanyetik boncuk seçimi ile izole edilebilir, floresan hücre izleyicileri ile boyanabilir, etiketlenmemiş kalan fraksiyonla yeniden karıştırılabilir ve böylece Vacchelli ve ark.27 ve Racioppi ve ark.34'te açıklanan çip üstü deneylerde bildirildiği gibi hedef kanser hücreleri ile karşı karşıya kalınabilir.
    1. Ko-kültür deneylerine başlamadan önce ve reaktiflerin eklenmesini kolaylaştırmak için, depolanan çipleri birkaç saniye boyunca bir oksijen plazma işlemi ile aktive edin. PDMS (polidimetilsiloksan) yüzeylerini kaplama adımlarına kadar hidrofilik tutmak için rezervuarları derhal deiyonize su veya PBS ile doldurun.
      NOT: PDMS doğası gereği hidrofobiktir, bu da mikrokanallardaki hava kabarcıklarının çalışmasında ve sıkışmasında zorluklara neden olabilir. Oksijen plazma aktivasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayan ek dosyadaki 7. adıma bakın.
    2. Bir UV kabini altında 20 dakika sterilize edin, taze PBS ile 2-3 kez yıkayın ve ardından 1 saat boyunca kültür ortamı ile inkübe edin. Kaplama adımlarını gerçekleştirene kadar talaşları inkübatörde tutun.
    3. Altı rezervuarın tümünden fazla ortamı çekin. Ana kültür odalarından medyayı emmekten kaçınmaya özen gösterin.
    4. Sol üst rezervuarda ve daha sonra alt kuyucukta 10-20 μL büyüme ortamında yeniden askıya alınan 1 × 105 kanser hücresini yavaşça uygulayın (Şekil 1A, rezervuar 1 ve 2). Hücrelerin tümör odasına yapışmasına izin vermek için 5 dakika bekleyin. Bazı hücreler rezervuarlara yerleşecek ve bağlanacaktır.
      NOT: Kanal açıklıklarının yanına hücresel süspansiyon takın. Bu prosedür MDA-MB-231 kanser hücrelerine uygulanır, diğer hatlar hücre yoğunluğu optimizasyonu gerektirecektir. Kanser hücresi bağlanmasını iyileştirmek için, yüzeylerin (örneğin, poli-L-lizin, fibronektin) bir kaplama işlevselliği gerçekleştirilebilir. Lütfen16, 48,49,50 numaralı kaplama adımları için daha önce yayınlanmış protokollere bakın.
    5. Sağ tarafta, 50 μL büyüme ortamında askıya alınan 1 × 106 PBMC'leri 3 ve 4 numaralı kuyucuklara yavaşça pipetleyin (bkz. Şekil 1A, rezervuar 3 ve 4).
      NOT: Aktıktan sonra PBMC, deneyin başlangıç noktasını temsil eden bir "ön" oluşturarak ara odaya dağılır.
    6. Altı rezervuarın tümünü 100-150 μL'ye kadar büyüme ortamı ile doldurun. Bir mikroskop altında, hücrelerin Şekil 1D-E'de gösterildiği gibi kültür bölmelerinde doğru dağılıp dağılmadığını kontrol edin. Son hacimler rezervuarların büyüklüğüne göre değişebilir. Ses düzeylerini tüm kuyucuklarda eşit olacak şekilde ayarlayın.
    7. Hızlandırılmış kayıttan önce sistemi stabilize etmek için çipleri yaklaşık 1 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Buharlaşma kayıplarına maruz kalabileceğinden her 3 günde bir taze ortam ekleyin.
      NOT: Sistem hem canlı/ölü hücre analizi hem de şartlandırılmış ortamdan dinamik multipleks sitokin sekresyon profillemesi ile uyumludur. Kemokin analizleri için, her bölmenin iki rezervuarından ortam toplanarak 200-250 μL'ye kadar süpernatant alikotuna erişilebilir. Klasik ELISA ve Luminex sitokin profilleme testleri yaklaşık 50 μL süpernatan gerektirir. Lütfen OOC modellerinde sitokin profillemesi yapan diğer laboratuvarların çalışmalarının 51,52 örneğine bakınız.
  3. Etiketlenmemiş kanser ve bağışıklık hücrelerinin hızlandırılmış edinimi
    NOT: Tipik olarak, tek bir mikroskop slaytı üzerinde 3 çip düzenlenir (bkz. 2B çip için Şekil 1A ve 3B çip için Şekil 4B). 4 slayt tahsis eden sahne tutucuları kullanarak, ortak kültürler, büyük deneysel koşul gruplarını analiz etmek için otomatik yüksek içerikli mikroskopi ile izlenmeye uygun olabilir. Talaşlar, yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için kalınlığı 1 mm veya 170 mikrona eşit olan slaytlara (plastik veya cam kapaklar, 6 delikli optik alt çok kuyucuklu) kolayca monte edilebilir.
    1. Bir inkübasyon sistemi ile donatılmış bir video mikroskopi kurulumu ile etiketlenmemiş hücrelerin parlak alan görüntü serilerini kaydedin.
      NOT: Burada zaman serisi veri kümeleri (zaman aralığı: 48 saat, kare hızı: 2 dakika), standart bir hücre kültürü inkübatörüne sığacak şekilde optimize edilmiş, 4x objektif ve CMOS 1.3M piksel ile donatılmış bir floresan mikroskobu ile elde edilmiştir.
    2. Edinmeye başlamadan önce mikroskobu 37 ° C ve% 5 CO 2'ye dengelemek için en az2 saat ısıtın.
    3. Mikrokanal dizisini tümör ve merkezi bölme arasında ortalayarak gözlem penceresini seçin. Bu, bağışıklık infiltrasyonunun dinamiklerini ve kanser hücrelerinin tohumlandığı bölgedeki etkileşimleri görselleştirmeyi sağlar.
    4. Kanser ve bağışıklık hücrelerinin aydınlatma yoğunluğunu ve odağını ayarlayın.
    5. Hızlandırılmış alımı başlatmak için, kare hızını ve zaman süresini deneye ve incelenen hücre türüne göre optimize edin.
      NOT: İyi bir sinyal-gürültü oranı (SNR) korunurken aşırı foto-pozlamayı önlemek için görüntüleme koşulları optimize edilmelidir. Bağışıklık hücreleri çok hareketli olduğundan, edinim kare hızının, ilgilenilen dinamik süreci takip etmek ve kolay izleme sağlamak için yeterince yüksek olması gerekir53. İzleme algoritması, elde edilen veri kümesinin boyutuyla uyumluluk ve gözlemlenen hücrelerin canlılığı, yoğunluğu ve hareketliliği arasında bir uzlaşmaya varılmalıdır.
    6. Hızlandırılmış çekimin sonunda, kare veri kümesini 25 fps sıkıştırılmamış bir video dosyasına dönüştürmek için ImageJ yazılımından Görüntü Dizisini İçe Aktar ve Farklı Kaydet işlevlerini kullanın.
      NOT: Oluşturulan video dosyası artık hücre izleme analizi için hazırdır. Burada, RGB (1280x1024 piksel) görüntüler 1,33 μm/piksel uzamsal çözünürlükte toplanmıştır. Tek bir görüş alanının (FOV) 24 saat süren bir filmi (3,5 GB yığını), her koşul için 720 kareden oluşur.
  4. Veri analizi: Trackmate tarafından etiketlenmemiş bağışıklık izlerinin yarı otomatik olarak çıkarılması
    NOT: Burada, 2D etiketsiz hızlandırılmış görüntülerde bağışıklık hareketliliği analizi TrackMate kullanılarak sürdürülmektedir54, Fiji/ImageJ yazılım paketinde (https://imagej.nih.gov/ij/) bulunan açık kaynaklı bir araç kutusu. Otomatik tek parçacık izleme gerçekleştirmek için çeşitli algoritmalar sağlanmıştır55Nokta benzeri yapıların (SPT). Bunlar, nesnelerin yüksek SNR'li karanlık bir arka plan üzerinde parlak olduğu floresan görüntülere verimli bir şekilde uygulanmıştır (yani, düşük çözünürlüklü floresan noktalar, etiketli trafik vezikülleri, çekirdekler)1,25,56,57,58. SPT esas olarak iki sıralı adıma dayanır. İlk olarak, nesneler şematize edildiği gibi birden çok çerçevede (segmentasyon) tanımlanmış konumlarla yerelleştirilir.Şekil 2. İkinci aşamada (parçacık bağlama), tespit edilen noktalar, hareketi tahmin etmek ve yörüngelerini bir iz şeklinde yeniden yapılandırmak için ardışık çerçeveler üzerinden bağlanır (Şekil 3). Sayısal özellikler zaman içinde çıkarılan her X, Y, Z koordinat dizisinden hesaplanabilir. Genişletilmiş belgeler şurada bildirilmiştir:54hem de çevrimiçi (http://imagej.net/TrackMate), TrackMate ile çalışmaya başlama öğreticisini takip ederek. İşlemin doğruluğu hemen denetlenebilir ve kullanıcıların her adımda ayarları yeniden yapmalarını sağlayan sezgisel bir grafik kullanıcı arayüzü (sihirbaz benzeri GUI) kullanılabilir. Aşağıdaki bölümde, görünür ışık görüntülerine uygulanan görüntü işleme ve niceleme adımları için Trackmate'in nasıl kullanılacağı kısaca gösterilmektedir:
    1. Fiji araç çubuğundaki tam zamanlı video/görüntü yığınını sürükleyip bırakın.
    2. Kalibrasyon yığını kurulumu (Şekil 2A).
      1. Boyutsallığı kontrol edin ve Görüntü> Özellikleri'ni seçerek görüntü özelliklerini atayın. Uzunluk dolum birimi, Piksel boyutları ve Kare aralığı kutuları.
        NOT: Kalibrasyonu gerçekleştirmek için, mikrokanalların bilinen uzunluğunu kullanın (500 μm, Şekil 1C) ve karşılık gelen ölçülen uzunluğa piksel cinsinden bölün. 2B zaman serisi için, 1'i z-dilimi olarak giren Z/T alanını ve doğru sayıda film karesi olarak değiştirdiğinizden emin olun. Bu başarılmazsa, Trackmate nicel çıktıları ve parametreleri piksel birimleri ve zaman dilimleri olarak raporlanır.
    3. Görüntülerin ön işlenmesi.
      1. Bağışıklık hücrelerinin gürültülü bir arka plandan doğru ayrımını geliştirmek için, artefaktları telafi etmek için parlak alan görüntülerini önceden işleyin. Veri kümelerinin 8 bit TIFF görüntülerden oluştuğundan emin olun (parlaklık aralığı: 0-255).
        NOT: Eşit olmayan aydınlatma, düşük SNR ve görünür ışık görüntülerindeki küçük enkaz parçacıklarının neden olduğu kontaminasyon, hücre izleme işleminin başarısını tehlikeye atabilir. Burada, zaman serisi veri kümeleri, arka plan çıkarma, parlaklık / kontrast ayarlama işlevi ve orijinal görüntülerden bir Gauss bulanıklığının yerel görüntü çıkarılması yoluyla önceden işlenir. ImageJ'de faz kontrastı veya parlak alan görüntülerinin işlenmesi ve segmentasyonu için Ampirik Degrade Eşiği (EGT)59 dahil olmak üzere başka farklı analiz araç setleri de bulunmaktadır.
    4. İlk kalibrasyon paneli (Şekil 2A)
      1. Görüntü yığını seçiliyken Trackmate'i başlatın (Eklentiler>İzleme).  Verilerin boyutsallığını ve zamansal penceresini (yani, piksel genişliği ve kare aralığı) gözden geçirin/onaylayın.
        NOT: TrackMate, kalibre edilmiş fiziksel birimlerde (yani, μm ve dakika) son izleme sonuçlarını vermek için görüntü özellikleri kutusunda otomatik olarak okur.
      2. Değerleri el ile ekleyerek veya etkin görüntünün üzerine kapalı bir alan çizerek ve ardından Kaynağı yenile düğmesine basarak bağışıklık izlerinin çıkarılmasını hesaplamak için ilgilenilen bir bölge tanımlayın. Küresel immün migrasyon yollarını çıkarmak için, sırasıyla mikrokanalların sağ tarafında (merkezi oda, Şekil 1E) ve solda (tümör odası, Şekil 1D) dikdörtgen bölgeleri seçin. Kanser ve bağışıklık noktaları arasındaki etkileşimleri analiz etmek için, YG araçlarını kullanarak dairesel alt bölgeler çizin (Düzenleme → Seçimi → Belirtin'e gidin).
        NOT: Bu araç kutusunu yeni bir biyolojik uygulamada ilk kez çalıştırırken, parçaları yeniden yapılandırmaya yönelik ayarları optimize etmek için gerekli zamanı harcayın.
        NOT: Ampirik olarak doğru yapılandırmayı bulmak için hücre yörüngelerinin (yaklaşık 50-100 hücre) manuel olarak izlenmesini sağlayın ve hareketlerin otomatik olarak çıkarılmasının güvenilirliğini bir ölçüt olarak doğrulayın. Ek olarak, seçilen parametrelerin doğruluğunu kolayca kontrol etmek için başlangıçta daha küçük bir alanda çalışın.
    5. İmmün nokta tespit adımı (Şekil 2B)
      1. Varsayılan Laplacian of Gauss (LoG) algılayıcısını seçin. LoG dedektörü, parlak, blob benzeri, yuvarlaksı nesneleri bulmak ve ara nokta boyutları (5 ila 20 piksel çapında) için ayarlanmış görüntüye bir Gauss Laplacian filtresi uygulamak için çalışır.
      2. Tahmini Blob Çapı alanına (burada, 10-13 μm) beklenen spot boyutundan biraz daha büyük bir değer girin. Nesne özelliklerini kaldırmadan ekstra sahte arka plan noktaları azaltılana kadar Eşik (burada 1-3 μm) değerini artırın. Eşik değerinin altındaki algılamalar (kalite metriklerine göre) sonraki analizlerden atılır. Nokta algılamanın kalitesini artırmak için medyan filtresi ve alt piksel yerelleştirmesi kutusunu işaretleyin.
      3. Görüntülerin üzerine macenta renkli daireler yerleştirmiş tanımlanmış bağışıklık hücrelerini görüntülemek ve hızlı bir şekilde incelemek için Önizleme düğmesini kullanın.
        NOT: Algılama sırasındaki hataların bağlama işlemi üzerinde önemli bir etkisi olacaktır. İstenmeyen diğer algılamalar, sonraki menülerde kullanıcı tanımlı filtrelerle (yani nokta yoğunluğu, boyutu veya konumuna göre) düzeltilebilir.
    6. Seçimlerden memnun kaldıktan sonra, İleri'ye basın.
      NOT: Bu ayarlar, deneysel kurulum ve elde etme görüntüleme yöntemlerine (örneğin, FOV, objektif büyütme, parlak alan veya floresan görüntüler), hücre tipine (yapışkan veya yüzen hücreler), yavaş veya hızlı hareketliliğe, hücresel davranış türüne (etkileşime giren veya girmeyen) ve gözlem alanındaki düşük / orta / yüksek yoğunluğa bağlı olarak değişebilir.
    7. Devam edin ve İlk Eşik Eşiği menüsünü atlayın. Hyperstack Displayer penceresini seçin.
    8. Filtreleri noktalar panelinde ayarlama (Şekil 2C).
      1. Şunu seçin: Tek Tip Renk. Şekil 2C'de gösterildiği gibi, ters çevrilebilir bir eşiğin üstünde veya altında, histogramda görüntülenen unsur değerlerine sahip etiketli noktaları korumak için filtreler eklenebilir.
    9. İzleyici seçim aşaması (Şekil 3A). Üç alanın doldurulmasını isteyen parçacık bağlama algoritması olarak Basit LAP izleyiciyi seçin (bu durumda, "Maksimum mesafeyi bağlama": 30-50 μm, "Boşluk kapatma maksimum mesafesi": 25-50 μm, "Boşluk kapatma maksimum çerçeve boşluğu": 4-6). Bu dedektör, boşluk kapatma olaylarını yönetir ve maliyet bağlama hesaplamasını yalnızca ilgili mesafelerine göre yapar.
      NOT: İzin verilen maksimum bağlantı mesafesi, aday eşleştirme noktaları için uzamsal arama aralığını sınırlar ve sonraki iki kare arasında kat edilen maksimum izin verilen yer değiştirmeye karşılık gelir (Şekil 3D).
      1. Yüksek derecede hareketli parçacıkların izlerinin parçalanması fark edildiğinde daha büyük maksimum yer değiştirme değerleri sağlayın.
        NOT: Kareden kareye hareket verilen maksimum mesafe değerinden büyükse iki bağlantı bağlanmaz. Segmentler iki farklı hücreyi kötü bir şekilde köprülüyorsa, maksimum yer değiştirmenin değerini azaltın.
      2. "Boşluk kapatma için maksimum mesafe" ve "maksimum çerçeve boşluğu" değerlerini değiştirerek eksik noktaları yeniden bağlamaya çalışın.
        NOT: Bu parametreler, bitişik olmayan karelerdeki boşluk kapatma olaylarıyla ilgilenir. Bazı kareler için nokta kaybolması meydana gelebilir (örneğin, odak dışı parçacıklar, FOV'da ve dışarıda kalan hücreler, gürültülü bir görüntüde segmentasyon arızaları).
        NOT: Bölme veya birleştirme olaylarını işlemek için, bağlantı maliyeti matrisi cezaları getiren dedektör olarak LAP bağlayıcıyı seçin.
    10. İzleme hesaplamasını çalıştırmak için İleri'yi tıklatın. İleri'ye basın.
    11. Filtreleme parçaları paneli (Şekil 3B). Açılır menüden "Track ID" veya diğer parça özelliklerini seçerek bağışıklık yollarının rengini değiştirin. Bu noktada, sonucun kalitesini artırmak ve yordamı yeniden gözden geçirmek için etkileşimli filtreleri işlevsel olarak ayarlamak üzere isteğe bağlı olarak seçin.
      NOT: Sahte noktalar görüntüdeki gürültüden ve özellik kalitesinin kaybından kaynaklanır. Bu, ilgilenilen hücreler birçok kare üzerinden izlenebilirken kısa segmentler oluşturacaktır.
      1. Kısa yolları kaldırmak için, içerdikleri nokta sayısına göre filtrelemeyi deneyin. Ek olarak, yanlış veya istenmeyen parçaları (toplam hızlandırılmış çekim süresine göre daha az kare içeren veya kirli veya hareket etmeyen parçacıklar içeren) sonraki son işlemlerden hariç tutmak için Parça yer değiştirme, İzleme süresi veya Minimum/Ortalama/MaksimumHız gibi seçeneklerin bir kombinasyonunu kullanarak parçaları sıralayın.
        NOT: Filtre seçimi, özel uygulamaya ve biyolojik sisteme bağlı olarak değişebilir.
    12. Görüntü Seçenekleri arabirimindeki tüm parçaları inceleyin, zaman içinde gezinin ve parçaların hücre geçiş yollarıyla ne kadar doğru eşleştiğini doğrulayın. Açılır menü, kolay görselleştirme ve çeşitli modalitelere (ör. kinetik parametreler, yoğunluk, zamansal veya uzamsal konum) göre filtreleme için noktalar ve yollar için renk kodları sağlar.
      NOT: Yüksek yoğunluklu kültürleri veya yüksek hareketli hücreleri izlemek için, ardışık zaman aralıklarında seyahat edilen hücre yer değiştirmesini en aza indirerek edinme kare hızını artırın.
    13. Segmentasyon ve bağlantı hatalarının manuel olarak düzeltilmesi (Şekil 3E).
      1. Sonuçların kalitesini daha da artırmak için, lekeleri (enkaz parçacıkları, sabit hücreler) manuel olarak düzenleyin ve tümör-bağışıklık etkileşimi YG'lerini analiz ederken tespit edilen tümör sınırlarından kaynaklanan hatalı izleri kaldırın.
      2. İlk olarak, ImageJ araç çubuğunda TrackMate aracını seçin. Tüm yığın boyunca varolan bir noktayı ortadan kaldırmak için shift tuşuna basın ve fare imleciyle hedef noktanın üzerinde bir ROI maskesi oluşturun (yeşil bir daire içinde düzenlenmiş) ve ardından DEL tuşuna basın.
      3. Yeni bir nokta eklemek için (lekelerin kaybolması nedeniyle eksik izler olması durumunda) fareyi sivri konuma getirerek A tuşuna basın. Bu adımdan sonra parça bağlama hesaplama işlemini yineleyin.
    14. Memnun kaldığınızda, üç metin dosyası oluşturmak için Görüntüleme Seçenekleri panelinde Analiz'i seçin (Şekil 3C ve 3F). "İz istatistiklerindeki noktalar" tablosu, bağışıklık noktalarının uzaysal zamansal koordinatlarını sağlar (ilişkili çerçeve ve parça numarası ile etiketlenmiş hücrelerin X-Y-Z konumları). "Pist istatistiklerindeki bağlantılar" ve "Pist istatistikleri" pistlerle ilgili bilgiler içerir: izleme süreleri, tespit edilen boşlukların veya noktaların sayısı, başlangıç ve stop-frame izleme vb. Her veri kümesi için kaydetme ve dışarı aktarma.
      NOT: Sonuç pencerelerinde bir satıra tıklandığında, görsel inceleme için hızlandırılmış videoda ilgili nokta, bağlantı veya parça etkinleştirilir. Parçaları seçmek/kaldırmak için filtreleme adımlarını tekrarlayın. Gelecekte dışa aktarılan tüm veriler güncellenecektir. İPUCU: Etkileşim YG'lerini işlerken kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki temas sürelerini hesaplamak için başlangıç ve stop-frame ve izleme süresi değerlerini izleyin.
    15. Tüm parametre değerlerini, görüntülerin yolunu ve zaman içindeki spot konumları içeren sonuçta ortaya çıkan bir XML dosyası oluşturmak için Kaydet düğmesine basın. ''TrackMate dosyasını yükle'' komutu (Eklentiler> İzleme), her film dosyası için tüm işlem oturumunu ayrı ayrı geri yükler.
    16. GUI'nin Eylem seç adlı son paneline gidin. Listede, parçaların üst üste bindirildiği bir video oluşturmak için Yakalamabindirmesi > Yürütme işlevini kullanın. İPUCU: Bir YG'deki bağışıklık hücrelerinin uzamsal yoğunluğunu hesaplamak için "Grafik N-noktaları vs zaman" seçeneği kullanılabilir (Şekil 6B, sağ panel).
    17. İşlem sonrası analiz ve göç istatistikleri
      1. Bağışıklık hücresi göç davranışını sınıflandırmak için kapsamlı kinetik parametreler29'u (yani, toplam yörünge uzunluğu, Öklid mesafesi, hapsetme oranı, ortalama kare yer değiştirme56, ortalama veya anlık iz hızı, durma katsayısı, göç açılarının dağılımı, İleri göç indeksi, ortalama düz çizgi hızı) hesaplamak için ham konumsal verileri doğrudan Trackmate'te analiz edin veya verileri dışa aktarın 31) ve hedef kanser hücrelerine yanıt (örneğin, tedavi vs kontrol).
        NOT: Kemotaksi ve Göç Aracı (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) gibi ek yararlı eklentiler, deneysel göç ve kemotaksi verilerinin gelişmiş analizi ve görselleştirilmesi için çeşitli grafikler (örneğin, Şekil 6'da gösterildiği gibi Gül veya sektör grafikleri) ve istatistiksel testler sağlar. Hücre izleme ve hücre segmentasyon algoritmalarını 24,25,45 birleştirmek, morfolojik metriklerin tek hücre düzeyinde (yani, hücre yüzey alanı, ana ve küçük eksen uzunluğu ve hücre en boy oranı) ölçülmesini sağlayabilir.

2. Rekabetçi bir tahlilde 3D immüno-yetkin kanser çip üstü model

NOT:Şekil 4'te  gösterilen 3D çip tasarımı, 5 ana bölmeden oluşur: yüzen bağışıklık hücreleri alımı için merkezi bir bölme, tümör hücrelerini hidrojel matrislerine (150-250 μm yüksekliğinde) gömmek için iki yan bölge ve ortam perfüzyon odaları. İmmün ve tümör odaları iki set dar mikrokanal dizisi ile bağlanır (200×12×10 μm3, L×W×H, Şekil 4E). Düzenli olarak 100 μm aralıklı yamuk ikizkenar mikrosütunlar (her bir yan jel bölgesi için yaklaşık 25-30 arayüz, Şekil 4C), yüzey gerilimi ve kılcal kuvvetler60,61 arasındaki dengeden yararlanarak enjeksiyon sırasında jel çözeltisini sınırlamak için bariyerler olarak çalışır ve bir jel-sıvı arayüzü ayarlamak için tümör bölgelerini iki lateral ek ortam odasına bağlar (Şekil 5). 3D rekabetçi testin ayrıntılı özellikleri Şekil 4'te gösterilmiştir. İmmün hücrelerin farklı tedavilere tabi tutulan tümör hücrelerini barındıran iki hidrojel bölmesine tercihli göçü izlenebilir ve ölçülebilir. Özel rekabetçi düzen, farklı kanser biyolojisi fenotiplerinin bolluğunu araştırmak için uygulanabilir (örneğin, ilaca dirençli vs agresif, birincil veya metastatik, yanıt verenler ve yanıt vermeyenler). Ek olarak, jel gömülü bölgeler, stromal bileşenler (fibroblastlar, endotel hücreleri)23 dahil olmak üzere daha heterojen TME'leri yeniden oluşturmak veya ilaç direnci ve tümör kaçış mekanizmalarını diseksiyon mekanizmaları için spesifik immünosüpresif ortam34'ü (örneğin, makrofajlar) simüle etmek için farklı hücre popülasyonlarıyla kolayca entegre edilebilir.
NOT: Nükleer ve aktif kaspaz boyaması, Canlı / ölü tahliller için ticari kitler kullanılarak (örneğin, Thermo Fisher Scientific, Incucyte reaktifleri), Nguyen ve ark.33'te bildirildiği gibi mitotik veya apoptotik ölüm olaylarını değerlendirmek için uygulanabilir.

  1. Hücrelerle matris çözeltisinin hazırlanması ve cihaza yüklenmesi
    NOT: Aşağıdaki deneysel ortamda, iki jel bölgesi, matris çözeltisinde (örneğin, Matrigel) yetiştirilen, monoterapi olarak veya kombinasyon halinde kullanılan terapötik ajanlara maruz kalan insan A375M melanom hücre hatlarının karışımlarını içerir. Bu ayar, iki ilacın bir kombinasyonunun tekli olanlara göre etkinliğini rekabetçi bir şekilde değerlendirmemize ve PBMC'leri çekme yeteneklerini ölçmemize izin verdi.
    1. Deneyden bir gün önce buz üzerine 4 ° C'lik bir buzdolabına yerleştirerek bir matris çözeltisi stoğunu (örneğin, Matrigel) defrost edin.
      NOT: Ürünü "topaklı" hale geldiği için birden fazla donma-çözülme döngüsüne maruz bırakmayın. Diğer sentetik veya doğal hidrojel protokolleri bu ayarda kullanılmak üzere uygun olabilir. Kollajen matrislerinde kanser hücrelerinin hazırlanması için lütfen 33,34,35'e bakınız.
    2. Matris çözeltisinde (2 mg mL-1) canlı uyumlu PKH67 Yeşil Floresan Hücre Bağlayıcı ile boyanmış A375 insan melanom hücrelerini yeniden askıya alın. Belirtildiğinde, DAC olarak adlandırılan 5-aza-2'-deoksisitidin (DAC; 2.5 μM) ve / veya IFN olarak adlandırılan IFN-α2b'yi uygun dozlardaekleyin 32.
      NOT: Matris şişesi teknik özellik sayfasındaki Lot # ile eşleştirin. Konsantrasyona bağlı olarak, 2 mg mL-1'e kadar yapmak için gereken ortamın hacmini hesaplayın Lütfen ilgilendiğiniz uygulamaya göre optimal protein konsantrasyonunu ve kanser hücresi süspansiyon konsantrasyonunu ayarlayın.
    3. Kabarcık oluşumunu önlemek için pipeti dikkatlice yukarı ve aşağı çekin. İstenmeyen polimerizasyonu önlemek için karıştırırken mikrosantrifüj tüpünü buz üzerinde tutun.
    4. Sterilizasyondan sonra, tüm hücre yükleme prosedürü sırasında matris çözeltisi katılaşmasını önlemek için cihazları buzun üzerine (bir buz kovası ve kapak kullanarak) yerleştirin.
    5. İki IFN ve DAC/IFN Matrigel/tümör hücresi karışımlarını (2-4 μL) sırasıyla sol ve sağ jel portuna, soğuk uçlar kullanarak 10-μL mikropipetle yavaşça enjekte edin (Şekil 5A). Matris çözeltisini bir taraftan diğer tarafa ulaşana kadar itmek için hafif basınç uygulayın.
      NOT: Bitişik kanallara taşmayı önlemek için matris çözeltisinin hacmi seçilmiştir. Çözeltinin ortama ve merkezi kanallara sızmasını önlemek için aşırı pipetleme baskısı uygulamayın. Yükleme sırasında jel yolu kanal boyunca tıkanırsa, jel cepheleri buluşana kadar çözeltiyi diğer girişten yerleştirmeyi deneyin. Mikropipeti girişlerden çıkarırken, pistonu tutun, aksi takdirde negatif basınç matris çözeltisini aspire edecektir.
    6. Matris çözeltisinin jelleşmesinin gerçekleşmesini sağlamak için cihazı 30 dakika boyunca 37 ° C'de dik konumda ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 5B). Jel kanalından sızmayı önlemek için gömülü polimerize edilmemiş jel içeren talaşları dikkatli bir şekilde kullanın.
    7. Bu arada, PKH67 etiketli PBMC'leri (1x106 hücreli) 10 μL'lik tam DMEM'de (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın ortamı) yeniden askıya alın.
    8. Matris jelasyonundan sonra, talaşlarda jel kurumasını önlemek için medya kanallarını altı rezervuarın hepsinde aynı kültür ortamı aliquot ile doldurun. Bağışıklık hücresi süspansiyonu tohumlanana kadar inkübatörde tutun.
      NOT: Mikroskop altında jeldeki tümör hücrelerinin doğru ve homojen dağılımını ve polimerize jel bariyerlerinin bütünlüğünü kontrol edin. Karışımdaki kısmen veya hiç düzgün olmayan jelleşmiş bölgeler veya kabarcıklar, basınç başlangıçtaki dalgalanmalar nedeniyle deneyin başlangıç noktasında jel ortam kanallarında PBMC'lerin erken akmasına neden olur.
    9. Altı kuyucuktan ortamı aspire edin ve orta basınçlı PBMC hücre süspansiyonu ile nazikçe enjekte etmek için ucu bir medya kanalının girişine yakın bir yere yerleştirin. Yükleme zamansal dizisi Şekil 5C'de gösterilmiştir:
      1. PBMC'ler 10 μL ortamda üst merkez kuyucuğuna girer.
      2. Yanal kanalların dört kuyusunun her birine 50-100 μL ortam.
      3. Üst merkez kuyucuğuna 40-90 μL orta.
      4. Alt merkezi kuyucuğa 50-100 μL ortam.
    10. Mikroskop altında, PBMC'lerin dağılımının yükleme adımından sonra merkezi odada sınırlı kaldığından emin olun. (Şekil 7A).
      NOT: Optimal değilse, gerekirse konsantrasyonu ayarlayın ve bozulmamış cipsler kullanarak tohumlama adımlarını tekrarlayın. Planlanan deneysel koşullar için hacimleri hesaplarken, potansiyel hataları ve ayarlamaları dikkate almak için fazla sayıda çipe (% 15-20) bakın. Hacimler ve konsantrasyonlar özel uygulamaya göre optimize edilmelidir.
    11. Daha sonra floresan görüntüleme elde etmek için monte edilmiş cihazları inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de düz bir yüzeye yerleştirin. Yüzen bağışıklık hücrelerini yükledikten sonra cipsleri dikkatli bir şekilde kullanın.
      NOT: Her 2-3 günde bir ortamı değiştirerek rezervuarlardaki buharlaşan hacim kayıplarını telafi edin. Kemokin profilleme için, iki kültür bölmesi kuyusunun her birinden 100 μL'ye kadar aspire edilebilir, lütfen adım 1'deki adım 2.7'ye bakın.
  2. ImageJ'deki tek kanallı floresan görüntülerde işe alınan PBMC'lerin Otomatik Sayımı
    NOT: Konfokal yüksek çözünürlüklü görüntüleme için klasik immünofloresan yöntemleri, çip üstü operasyonlara son nokta ölçümleri olarak uygulanabilir. Temel boyama prosedürü, hücre çip üzerinde fiksasyon, permeabilizasyon, bloke etme, antikor bağlanması, çekirdeklerin boyanması ve aralarında yıkama adımları ile yer alır. Gömülü kanser mikro ortamlarına sahip 3D jel bölgelerine sızan etiketlenmemiş bağışıklık hücreleri, istenen zaman noktalarında sabitlenebilir ve aktivasyon / tükenme / olgunlaşma ekspresyon belirteçleri için boyanabilir (örneğin, CD8 hücreleri için, CD69, CD95, PD1, TIM3 belirteçlerinin izlenmesi). Parlato ve ark.35SW620 apoptotik hücrelerin fagositozu, 170 μm kalınlığında kapaklara monte edilmiş cihazlar kullanılarak konfokal mikroskopi ile değerlendirildi. IFN-DC'ler, çip üzerinde insan karşıtı HLA-DR-FITC Ab aliquots eklenerek boyandı.
    Rekabetçi sinyallerle meydan okuyan sızmış floresan boyalı canlı bağışıklık hücrelerinin kapsamını hesaplamak için, ortak bir görüntü analizi iş akışı aşağıdaki gibi ayarlanmıştır (Şekil 7D-G):
    1. Farmakolojik rejimlerin tek veya kombinasyonlarına maruz kalan tümör hücrelerini içeren sol ve sağ jel bölgelerinin belirli zaman sonlanım noktalarını, faz kontrastını ve kırmızı / yeşil kanalları floresan mikrofotolarını elde edin.
      NOT: Burada görüntüler EVOS-FL floresan mikroskobu ile hücre yüklemesinden sonra (0 saat), 48 saat sonra ve 72 saatlik inkübasyondan sonra yakalanmıştır (Şekil 7A-B). Merkezi odayı, mikrokanal dizilerini ve A375 artı IFN ve A375 artı DAC / IFN içeren yan yana yerleştirilmiş iki yan kanalı elde etmek için 4x-10x büyütme kullanıldı.
      1. Satın alma işlemlerini gerçekleştirirken, sayılacak özelliklerin doygunluğunu ölçmek ve önlemek için parametreleri göz önünde bulundurun. Optimal segmentasyon sonuçları, biyolojik numunelerin kendilerindeki değişkenlik, boyama kalitesi ve kullanıcı odaklı uygulamalar için kullanılan mikroskopi teknikleri nedeniyle elde edilen görüntülerin doğasına bağlıdır.
    2. Floresan tek kanallı verileri (bu durumda kırmızı = PBMC'ler), Fiji'de ana pencereye sürükleyerek yükleyin (Şekil 7D). Son segmentasyona kadar ön işleme filtrelerinin seçimi sırasında ham verilerin üzerine yazılmasını önlemek için görüntüyü çoğaltın.
      1. Görüntü renkli bir görüntüyse (RGB), gri tonlamaya dönüştürmek için Image > Type 8 veya 16 bit tuşuna basın. Dönüştürme sırasında Düzenleme > Seçenekleri > Dönüşümlers'nin ölçeklendirilecek şekilde ayarlandığından emin olun.
    3. Gürültü ve eserlerin temizlenmesi yoluyla ham verilerin önceden işlenmesi.
      1. Büyük uzamsal yoğunluk varyasyonlarına sahip düzensiz gürültü arka planını düzeltmek için yuvarlanan top algoritmasını uygulayarak Arka Planı İşleme > Çıkarma menüsüne gidin. Yarıçapı en azından en büyük ön plan parçacığının boyutuna ayarlayın. En iyi sonuçları elde etmek için deneme yanılma prosedürü için Önizleme kutusunu seçin. Çok küçük değerler, ilgilenilen yapıları yanlış bir şekilde kaldırabilir.
      2. Parlaklık ve Kontrast komutunda, histogramdaki yoğunluk aralığını değiştirmek için Minimum/Maksimum kaydırıcılarını sürükleyin. Yıkama özellikleri olmadan parlaklığı artırmak için Maksimum kaydırıcıyı sola kaydırın. Arka planda daha az görünür özelliklerin kaybolmasını önlemek için görüntünün kontrastını artırmak için Minimum slaytı sağa hareket ettirin. Değişiklikleri düzeltmek için Uygula'yı tıklayın.
    4. Görüntü İyileştirme.
      1. İşleme > Filtreleri'ne gidin ve görüntülerdeki Medyan, Gauss filtrelerini deneyin (Şekil 7E).
        NOT: Ön filtreleme yarıçapı görüntü paraziti piksellerine uyarlanmalıdır. Doğrusal olmayan Medyan filtresi, tuz ve karabiber gürültüsünü azaltmak için piksel değerini komşuların medyan değeriyle değiştirir. "Gauss Bulanıklığı", pikselleri çevreleyen piksellerin ağırlıklı ortalamasıyla değiştirerek dijital bir resmi yumuşatmak için kullanılır. Ağırlıklar Gauss olasılık dağılımından gelir, bu nedenle en yakın pikseller daha etkilidir.
      2. İsteğe bağlı olarak, kontrastı artırmak için işaretli Önizleme kutusuyla > Matematik > Gama İşleme'ye gidin.
        NOT: B&C panelinde ayarlanan yoğunluklar iki min ve max sınırı arasında ölçeklendirilir. 1,0 < değerler düşük yoğunluklar arasındaki farkları vurgularken, 1,0 > değerler yüksek yoğunluklar arasındaki farkları vurgular. Gama düzeltme, en parlak nesneleri doyurmadan en sönük nesneleri gösteren bir ekran aralığı bulmak için işlevseldir.
    5. İkili görüntü maskesi oluşturma.
      1. Görüntü'ye gidin > > eşiğini ayarlayın. Eşikleri belirlemek için en basit yöntem, Şekil 7F'de gösterildiği gibi yoğunluk seviyelerinin histogram analizine dayanır. Açılır menüde, farklı küresel eşik yöntemleriyle oynayın (bizim durumumuzda, Otsu uygulanır).
      2. Histogram panellerinde bilinen bir piksel yoğunluğu aralığını manuel olarak kaydırın veya yazın, çoğunlukla gerçek hücre alanına benzeyen görüntüyü kaplayan kırmızı desenin değişimini gözlemleyin. Sıfırla düğmesi bindirmeyi kaldırır. Memnun kaldıktan sonra, görüntünün ikili bir sürümünü oluşturmak için Uygula'yı tıklatın. Eşikli görüntüler>in nasıl görüntülendiğini ve nesnelerin Parçacık Analizörü tarafından nasıl tanımlandığını kontrol etmek için İkili > Seçenekleri İşlemini kontrol edin.
    6. Eşik sırasında kısmen çakışan veya birleştirilen parçacıkları bölmek için İşlem/İkili/Havza Parçacıkları menü komutunu kullanın. Havza genellikle 1 piksel kalınlığında bir çizgi ekleyerek bunları doğru bir şekilde kesebilir. Pikselleri büyütmek veya kaldırmak için Dilat veya Aşındırma işlemleri gibi morfolojik işlemler gerçekleştirin veya piksellerin altındaki veya aşırı doygunluğundaki pikselleri kaldırın.
      NOT: Daha fazla bilgi için Menü Komutları bölümüne bakın veya ikili verileri işlemek için matematiksel morfolojiye dayanan entegre bir kütüphane olan MorphoLibJ'ye bakın.
    7. Kantitatif Görüntü Özelliği Açıklaması.
      1. Tatmin edici nesne tanıma elde edildikten sonra, Parçacıkları Analiz > Analiz Et'ten Partikül Analizörü'nü açın. Parçacıklar, piksel cinsinden veya kalibre edilmiş bir ölçüm biriminde ifade edilen boyutları ve dairesellikleri ile hariç tutulabilir (Görüntü > Özellikleri altındaki mikroskop ayarlarına göre doğru ölçeği kontrol edin). Her şeyi dahil etmek için, varsayılan 0-Sonsuzluk ve dairesellik varsayılan aralığını 0,00 - 1,00 arasında tutun (0 = düz çizgi, 1 = mükemmel daire).
      2. Küçük "gürültülü" pikselleri veya ilgilenmeyen özellikleri filtrelemek için minimum ve maksimum aralığı ayarlayın. Pencere alanındaki Delikleri Dahil Et, Göster, Anahat ve Sonuçları Görüntüle seçeneklerini işaretleyin. Kenarlarda Hariç Tut, görüntünün kenarlıklarında algılanan parçacıkları atar. Yöneticiye Ekle, elde edilen seçimi, parçacığın konum bilgilerini saklayarak daha fazla analiz için ROI yöneticisine ekler.
        NOT: "ROI Manager" da, otomatik segmentasyon kayıtlı çıktısını düzeltmek mümkündür (bölünmüş hücreleri birleştir, birleştirilmiş hücreleri böl). Fiji Araç Çubuğu'ndaki seçim araçlarını kullanarak, bağışıklık infiltrasyonunu tahmin etmek için kanser hücrelerinin gömülü olduğu her iki jel bölgesindeki yatırım getirilerini seçin.
    8. Şekil 7G'de gösterildiği gibi istatistiksel analiz yapmak için elde edilen değerleri bir elektronik tabloya aktarın. "Sonuçlar", tanımlanan numaralandırılmış ana hatlarıyla belirtilen parçacık özelliklerine göre bir veri tablosunu listeler. "Özetle", görüntünün adını, toplam sayıları ve tüm görüntü için diğer bilgileri içeren bir pencere açar.
      1. Çok çeşitli parametreleri dahil etmek için Ölçümleri Analiz Et > Ayarla'ya gidin.
    9. İşleme iş akışını otomatikleştirmek ve büyük veri kümelerinde analizden zaman kazanmak için isteğe bağlı olarak bir makro kaydedin (Eklentiler > Makrolar > Kaydet'i seçerek).
      1. 3B bölgelerdeki tümör hücrelerinin morfolojik değişikliklerini analiz etmek için aynı bölgelerdeki yeşil floresan kanalını analiz etmek için aynı işleme rutinini kullanın16

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tümör immün infiltrasyonu, konakçı anti-tümör yanıtının bir parametresidir. Tümörler, infiltrasyon yapan lökositlerin bileşimi, yoğunluğu, lokalizasyonu ve fonksiyonel durumu bakımından heterojendir ve kanser hücreleri ile etkileşimler, hastalığın seyrini ve tedaviye yanıtı tahmin etmek için klinik olarak ilgili bilgilerin altında yatabilir. Bu anlamda, mikroakışkan teknolojiler, tümörlerin bağışıklık konstrüksiyonunu keşfetmek ve antikanser tedavilerine yanıtı izlemek için tamamlayıcı ve ayrıcalıklı in vitro araçlar olarak kullanılabilir. Mikroakışkan tahlilinin, canlı hücre görüntülemenin ve izleme yazılımının bağlanması, bağışıklık hücrelerinin göç modellerini farklı bağlamlarda nasıl ayarladıklarını ölçmek için güvenilir niceleme yöntemleri oluşturabilir. Bu bölümde, standart yumuşak-litografik prosedürlerle gerçekleştirilen geçici mikroakışkan cihazlarda immün ve hedef kanser hücrelerinin çok yönlü 2D veya 3D ko-kültürlerinin kurulmasına yönelik adımları bildirdik. Bölüm 1'de, yapışkan (MDA-MB-231 kanser hücreleri) ve yapışkan olmayan (PBMC'ler) popülasyonlar arasında kimyasal ve fiziksel temaslara izin vermek için mikroakışkan cihazlar kullanılmıştır. Bazı kemoterapötik ajanlar (örneğin, diğerleri arasında antrasiklinler) malign hücrelerin "immünojenik" apoptozunu indükleyebilir, böylece immünkompetan konakçılarda görünürlüklerini artırabilir. Kanser immünojenik hücre ölümü (ICD), bağışıklık hücreleri için alarmin olarak işlev gören ölmekte olan hücreler tarafından iletilen membrana bağlı ve çözünür sinyallerin salınması ile karakterizedir. ICD yanıtının nicel bir doğrulamasını sağlamak için, lökositlerin uygun şekilde inşa edilmiş mikrokanal köprülerinden hedef hücrelerine doğru hareket edebildiği mikroakışkan platformda toplanan verileri kullanıyoruz. Hızlandırılmış kayıtlar, PBMC'lerin sağlıklı donörlerden (WT, vahşi tip), antrasiklin DOXO ile önceden tedavi edilmiş veya edilmemiş insan MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri ile birlikte yüklenmesinden sonra gerçekleştirildi. Mikrofotograflar her 2 dakikada bir, 24 ve 48 saatlik iki ardışık zaman aralığı için üretildi. (Örnek Film S1 0-24 saat aralıklarla). Ölmekte olan (DOXO ile tedavi edilen) veya canlı (PBS ile tedavi edilen) kanser hücreleri ile mücadele eden bireysel PBMC'lerin izleme analizi, Trackmate eklentisi kullanılarak yapıldı. Şekil 6A (sol panel). İlgili kemotaksis değerleri ve migrasyon grafikleri, aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Kemotaksi ve Migrasyon Aracı kullanılarak otomatik olarak oluşturulmuştur.62. Hücre yörüngelerinin tümü 24 saat zamanda (x, y) = 0 olarak tahmin edildi. Sonuçlar, DOXO veya PBS'ye maruz kalan meme kanseri hücreleri ile birlikte yüklendiğinde bağışıklık hücrelerinin farklı bir göçmen profilini gösterdi. PBMC'ler apoptotik kanser hücreleri ile karşı karşıya kaldıklarında, mikrokanalları ölmekte olan / ölü hücrelere doğru geçtiler (ancak tedavi edilmemiş hücreleri yaşamak için değil). Migrasyon X / Y örümcek ve gül arazileri, sol panelde sunulmuştur Şekil 6B-C, immünojenik indükleyici ajanların immün dinamiklerdeki farklılıklar üzerindeki etkisini vurgulamak için haritalandı ve karşılaştırıldı. Gül grafikleri, PBMC'lerin kontrol deneyinde esas olarak hemen hemen her yöne göç ettiğini, sadece ihmal edilebilir bir fraksiyonun, çoğalan kanser hücreleri tarafından üretilen gradyanı yukarı doğru yönlendirdiğini göstermektedir. Tersine, bireysel hücrelerin yolları, apoptotik meme kanseri hücrelerinin yönü boyunca (negatif x yönü) güçlü bir önyargı hareketini vurgulamaktadır. DOXO ile tedavi edilen veya PBS ile tedavi edilen kanser hücrelerine yönelik yönlendirilmiş bağışıklık hücresi göçünü değerlendirmek için, aşağıdakiler de dahil olmak üzere çeşitli kemotaksis parametreleri hesaplanır: a) kütle merkezi (tüm uç noktaların uzamsal ortalama noktası); b) yönlülük; c) İleriye doğru migrasyon indeksi (yani, bizim durumumuzda hedef tümör bölgesine doğru anlamına gelen ilgi yönündeki ortalama hücre yer değiştirmesi). İkinci değerler, bir hücrenin kemotaktik uyaranlar verilen yönde göç etme etkinliğinin bir ölçümünü temsil eder. Sol odaya ulaştıktan sonra, 24-48 saat boyunca artan yoğunluğa sahip lökositlerin bir kısmı, DOXO ile tedavi edilen MDA-MB-231 ile uzun süreli (>60 dakika) temas sergiledi. PBMC'ler, canlı kanser hücreleriyle bu kadar uzun vadeli ve kalıcı etkileşimlere kitlesel olarak göç etmekte ve girememektedir (yaklaşan PBMC'lerin temsili mikrofotoğraflarında gösterildiği gibi). Şekil 6A, sağda). Tümör-immün etkileşimindeki farklılıkları ölçmek için, tümör bölgesi "sıcak nokta" olarak adlandırılan 20-80 mikron arasında değişen sabit bir çap çemberi ile tanımlanmıştır. Temsili FOV'lardan elde edilen niceleme ve analizler şu şekilde gösterilmiştir: Şekil 6 (Sağ panel, B-C).

Bölüm 2'de, epigenetik ilaçların anti-kanser kombinasyonlarına yanıt olarak bağışıklık hücrelerinin işe alımını ölçmek için yeni bir 3D immüno-yetkin tümör modeli tanımlanmıştır32 (DAC / IFN vs IFN tek başına), A375 melanom hücrelerinin iki farklı tedavi koşullarının aynı anda karşılaştırılmasına izin vermiştir. Böylece, PKH67 yeşil floresan boya ile etiketlenmiş A375M melanom hücreleri, her jel odasına DAC ve / veya IFN varlığında Matrigel matrislerine gömülürken, PKH26 kırmızı etiketli PBMC'ler başlangıç noktasında merkezi akışkan odaya homojen olarak dağıtılmıştır (Şekil 7A). PBMC'leri çekme kapasiteleri için 3D matrislerdeki iki tümör kitlesini aynı anda karşılaştırdık. 48 ve 72 saatte, PBMC'ler Şekil 7B'de gözlemlendiği gibi sağ taraftaki mikrokanallara kitlesel olarak yönlendirilir.

PBMC'lerin IFN ile tedavi edilen melanom bölgesi yerine DAC / IFN ile tedavi edilen jel matrisine doğru tercihli bir homingi açıkça gözlenirken, tek tedaviye maruz kalan A375 hücrelerine (sol çip tarafı) karşı zayıf migrasyon oranı gözlendi. Rekabetçi ortam, farklı kanser biyolojisi fenotiplerinin bolluğunu araştırmak için geçerlidir (örneğin, ilaca dirençli vs agresif, birincil veya metastatik (örneğin, A375P vs A375M melanom hücreleri) ve yanıt verenler ve yanıt vermeyenler). Jel odaları, TME düzeyinde ilaç yanıtlarını karakterize etmek için malign hücrelerin karmaşık ko-kültürlerinden ve endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve fibroblastlar33 gibi kanserli olmayan tümörle ilişkili çoklu hücrelerden oluşabilir. Kanser hücrelerinin mitoz ve apoptotik ölüm olayları, canlı boyalarla boyanarak izlenebilir33. 3D mikroakışkan cihazlardaki immün boyama prosedürleri, konfokal mikroskopi ile tümör bölgelerinde sızmış bağışıklık hücrelerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için uyarlanabilir35. Bu anlamda, bu 3D mikroakışkan sistemler karmaşık tümör yapılarını ve çok hücreli etkileşimleri taklit edebilir ve bu nedenle daha güvenilir preklinik ilaç testleri için değerli platformlardır.

Figure 1
Şekil 1. 2D tümör-immün ko-kültürlerin montajı için mikroakışkan cihazın planimetrisi. (A) Tek bir mikroskop slaytına monte edilmiş 3 çipin gerçek mikrofotografı. Rezervuarlar, yükleme sırasına bağlı olarak numaralandırılır ve göstergede listelenen ilgili kültür odaları olarak renk kodludur. Scalebar, 6 mm. (B) mikro oluklarla birbirine bağlanmış üç ana hücre kültürü alanından oluşan 3D CAD çip. C) Kanser hücrelerine ve PBMC'lerin boyutuna göre uyarlanmış boyutları gösteren dar mikro oluklu köprünün detayları. D-E) Görünür ışık mikrofotografı, zaman atlamasının başlamasından önce, kanser hücrelerinin ve PBMC'lerin sırasıyla sol ve ara odadaki dağılımını gösteren elde edildi. Ölçek çubuğu, 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Zaman serisi görüntülerinde bağışıklık noktalarının lokalizasyonu için Trackmate analiz hattı. A) Üst panel: Trackmate görüntü kalibrasyon menüsünün ekran görüntüsü. Alt panel: Zaman ve uzamsal birimleri ayarlamak için Fiji "Görüntü özellikleri menüsü". B) Üst panel: Trackmate "Nokta algılama" menüsünün ekran görüntüsü. Alt panel: Farklı "Eşik" değerleri uygulanmış çıktı görüntüsü. C) Üst panel: Bazı filtreleri gösteren Trackmate "Spot filtreleme" menüsünün ekran görüntüsü. Alt panel: Ara odadaki X boyunca pozisyona göre filtrelenmiş bağışıklık noktalarını gösteren örnek hızlandırılmış görüntü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Zaman serisi görüntü dizilerinde bağışıklık izlerini yeniden yapılandırmak için Trackmate Analysis ardışık düzeni. A-C) Parça oluşturma, parça filtreleme ve nihai verileri dışa aktarma için Trackmate menülerinin ekran görüntüleri. D) Bağlantı dedektörü ayarlarını değiştiren önceden işlenmiş hızlandırılmış görüntülerde oluşturulan parça örnekleri. E) Tümör hücrelerinin sınırlarının tespitinden kaynaklanan yanlış izler ve kötü bağlantılar örneği. F) İzler, sonuçlar .txt dosyadaki satırlar seçilerek yeşil renkle vurgulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. 3D immünkompetan tümör çipleri için şematik genel bakış. A) Mikro yapılı silikon ustası örneği. PDMS pulları, e-ışın ve optik litografi ile donatılmış bir temiz oda tesisinde SU-8 negatif dirençte desenlenmiştir. B) PDMS replikaları standart soft-litografi yöntemleriyle üretilmiştir. Merkezi ünite, panelde tasvir edilen çipin 3D render'ında çizilenler gibi renkli odalara sahiptir D. C) Taramalı elektron mikroskobu (SEM), hidrojel çözeltisi tuzağına uygun mikrosütunlar dizisinin genişletilmiş görünümü. D) Mikro oluklarla bağlanan odaları ve yükleme kuyularını gösteren 3D CAD. Kesikli kutular, ayrıntıların SEM fotoğraflarına (panel C ve E) atıfta bulunur. E) 10 μm yüksekliğinde bağlantı mikro oluklarının SEM fotoğrafı. f) Mikroyapıların boyutlarını gösteren 2D CAD düzeni. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. 3B ortak kültürleri birleştirmek için ana yükleme protokolü adımlarının şematik iş akışı. A) Üst panel: Matrigel çözeltisinin her jel yan bölgesindeki enjeksiyon adımının şematiği. Alt panel: Yükleme adımı sırasında kanal boyunca jel ön ilerlemesini gösteren çipin gerçek fotoğrafı. B) Matrigel polimerizasyon adımının şematiği. Alt panel: Jelasyon adımından sonra oluşan jel-hava arayüzünün faz-kontrast mikroskobik görünümü. Ölçek çubuğu, 100 μm. C)Üst panel: Protokolde kullanılan örnek hacimlerle hücrelerin ve ortamların yüklenmesini gösteren çizim. Alt panel: Birleştirilmiş ortak kültürün 0 saatte 4X Faz-kontrast görüntüsü gösterilir. Ölçek çubuğu, 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6. PBMC'nin göç profillerinin ve ölmekte olan / canlı tümör odasına yönelik etkileşim davranışlarının 24-48 saatlik zaman penceresinde analizi. Sol panel. A) Trackmate tarafından çıkarılan, bağışıklık renkli izlerle kaplanmış hızlandırılmış önceden işlenmiş görüntülerin ekran görüntüleri. İmmün yollar, belirtilen deney koşullarında, ara odada 24 ila 48 saat aralığında tek bir FOV ile elde edilir. B-C) İki farklı koşulda yetiştirilen PBMC'lerin temsili göç izleri ve gül arazileri (n = 1550 PBMC'ye karşı DOXO ile tedavi edilen kanser hücreleri, DOXO + veya n = 1434 PBMC'lere karşı kontrol kanser hücreleri, DOXO-). X-y grafiklerinin içindeki her çizgi tek bir PBMC yörüngesini gösterir ve her daire, başlangıç konumuna göre tek bir hücrenin son konumunu temsil eder. Başlangıç noktaları bir koordinat dönüşümü kullanılarak (0,0) olarak ayarlanır. Hücre göçünün kütle merkezinin koordinatları ve yer değiştirmesi, belirtilen deneysel koşullarda görüntülenir. Kütle koordinatlarının ve yer değiştirmenin merkezi (X ve Y bileşenleri için ortalama Öklid mesafesi olarak hesaplanır), hücre grubunun öncelikle seyahat ettiği ortalama yönün ve koşul gruplarındaki genel hücre hareketinin büyüklüğünün göstergesini sağlar. Mavi ve yeşil çizgiler sırasıyla tek tek izleri bir eşik değerinden (100 μm) daha büyük/daha küçük Öklid mesafe değerine göre işaretler. D) Bir hücre izi tarafından çıkarılan sayısal verilerin şeması. E-F) Kutu ve Bıyıklar, sırasıyla yönlülüğü (p<0,0001 Welch'in düzeltmesi ile eşleştirilmemiş t testi) ve FMI (p<0,0001 Welch'in düzeltmesi ile eşleştirilmemiş t testi) gösteren çizim. Kutulardaki yatay çizgi medyan değerleri temsil eder. FMI değerleri, her koşul grubundaki tüm hücre izlerinin ortalamasıdır. Sağ panel. A) PBMC'ler ile DOXO veya PBS ile tedavi edilen kanser hücreleri arasındaki diferansiyel etkileşimleri gösteren Trackmate ayıklanmış YG'lerin ekran görüntüleri. B) PBMC'lerin DOXO ile tedavi edilen veya kontrol edilen MDA-MB-231 kanser hücreleri etrafındaki zaman yoğunluğu. Her durum için kanser hücreleri etrafında seçilen ROI'ye mevcut PBMC sayısı. Bildirilen değerler, tek bir hızlandırılmış FOV'dan seçilen 9 YG'nin üzerindeki ortalamadır. Kanser sıcak noktaları bir ROI (çapı 80 μm) ile tanımlanır. İlgili yoğunluk ısı haritası görüntülenir. Noktalar, belirtilen zaman noktalarında 9 kanser sıcak noktası üzerinden hesaplanan ortalama hücre sayısını temsil eder. c) Her deney grubu için temaslıların zamanlarının (min) dağılımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7. Çip modelinde rekabetçi bir 3D immüno-yetkin melanomda DAC artı IFN ilaç kombinasyonlarına yanıt olarak PBMC'lerin tercihli işe alımı. A) Başlangıçta yüklenen PBMC'lerin mikroakışkan cihazların merkezi odasına dağıtılması. Mikrofotolar EVOS-FL floresan mikroskobu ile 0-72 saat aralıklarla elde edilir. Kırmızı floresan (PKH67 etiketli hücreler), sağlıklı donörlerden PBMC'leri temsil eder. Tek veya çift kombinasyonlu tedaviler içeren Matrigel'e gömülü PKH67 etiketli (yeşil) insan melanom hücreleri lateral odalara kaplandı. B) A375 hücreleri artı solda IFN, sağda A375 artı DAC / IFN. Floresan görüntüler 72 saatlik ko-kültürde gösterildi. Üretimi durdurulan sarı kutu, A375 artı DAC / IFN tarafında gözle görülür derecede büyük işe alımları göstermektedir. C) PBMC, IFN odalarından DAC+IFN odalarına karşı dört farklı yatırım getirisinde sayılır. Histogramlar hücre sayılarını temsil eder +/- S.D.; ısı haritası her YG'den numaralandırılmış değerler. Ölçek çubukları, 200 μm. D-G) Tek kanallı floresan görüntülere uygulanan jel matrislerde infiltre PBMC'lerin segmentasyon şematikleri ve nicelleştirme adımları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya. Mikrofabrikasyon protokolü Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film 1. 2D tümör bağışıklığı çip üstü ko-kültürde hızlandırılmış sekanslar. Mikrofotograflar her 2 dakikada bir, 0-24 saatlik bir zaman aralığında, standart bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirilen kompakt bir mikroskop vasıtasıyla elde edildi. Sol panel. MDA-MB-231 kontrol meme kanseri hücreleri ile kaplanmış sağlıklı donörlerden (WT, vahşi tip) PBMC'lerin filmi. Sağ panel. PBMC'lerin WT'nin, MDA-MB-231 DOXO ile tedavi edilen kanser hücrelerinin yüklendiği çip odasına doğru büyük bir göçünün filmi. 2D çip düzeni, Protokolün 1. bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmış ve Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan yöntemler, onko-immünoloji alanında, daha ilgili in vitro modellerin benimsenmesinden yararlanabilecek iki önemli yönü, modüle edilebilir karmaşıklık derecesiyle özetlemek için genel bir yaklaşım tasarlamaya çalışmaktadır. Birincisi, tek hücre özelliklerinin ele alınmasının, heterojenliğin daha iyi tanımlanmasına ve tedaviye direnç, metastaza propulsiyon, kök hücre ve farklılaşma derecesi dahil olmak üzere ilişkili biyolojik ve klinik öneme yol açabileceği tümör hücresi popülasyonu tarafını içerir. Hikayenin diğer tarafı, kanserli olmayan bileşenler (bağışıklık ve stromal hücreler, kan damarları) ve kimyasal / fiziksel manzara (ECM bileşenleri, kemokinler ve salınan diğer çözünür faktörler) dahil olmak üzere TME ile temsil edilmektedir ve bu da hem hastalığın özelliklerini hem de bireyin tedaviye yanıtını derinden şekillendirebilir63, özellikle immünoterapiye. Açıklanan yaklaşımın diğer araştırma alanlarına ihraç edilmesinin, yeni modellerin geliştirilmesi ve benimsenmesinin getirdiği sınırlamaların ve zorlukların derinlemesine anlaşılmasını gerektirdiğini belirtmek gerekir.

Mühendislik modellemesinde uygulanan bir maksimumdan alıntı yaparak ("sistemi değil problemi modelleyin"), tüm deney boyunca kendi çip üstü modelini biyolojik olarak alakalı ve istikrarlı hale getirmek için gereken minimum sayıda (hücresel, fiziksel ve kimyasal) bileşen ve koşul olan optimize edilmelidir. Bu nedenle, hücre tiplerinin / mikroçevresel/deneysel ortamın her kombinasyonu, tek deneyler boyunca ve oturumdan oturuma doğru bir şekilde seçilmeli, değerlendirilmeli ve sürekli olarak izlenmelidir. Bu kontroller, protokol bölümlerinde belirtildiği gibi, nem koşulları veya aydınlatma kaynaklarından ısıtma ile değiştirilebilen mikroakışkan cihazlardaki hacimler, kontrolsüz sıvı sürüklenmelerine neden olan aşamaların olası hareketleri ve düzlemselliği gibi parametrelerin sıkı kontrolünü ve aynı zamanda hücre durumunun, canlılığının ve fenotipik karakterizasyonun bazı son nokta doğrulamasını içerir. Kritik bir adım, vaskülarize (benzer) yapılar oluşturmak veya çip üzerinde ilaç dağıtımı için perfüzyon sistemlerini kullanma kararı ile ilgilidir33, çünkü bu, deneyleri artan karmaşıklık, hücre kültürü süresi ve bağışıklık gibi yüzen hücrelerin varlığında kimyasal faktörlerin modülasyonu açısından etkileyebilir.

Aşağıda, deneysel ortamlarda ve en son literatürde bulunan ana kritik ve ilgili konuları özetliyoruz.

ECM ve kimyasal peyzaj tanımı
TME, çevrenin mekanik 64,65 özelliklerinden de derinden etkilenir63, 66. Bu nedenle, kültür matrisinin seçimi, özellikle belirli koşullarda, matrisin kendisi tarafından salınan sinyallere cevap verebilecek bağışıklık hücreleriyle uğraşırken esastır. Gelecek gelecekte, giderek daha rafine ve kontrol edilebilir bir ECM'yi mümkün kılan, bugün farklı dokuların, yarın farklı hastaların özgüllüklerini taklit eden yeni malzemelerin ve hidrojellerin (diğer parametrelerin yanı sıra farklı sertlik, gözeneklilik, çözünür faktörlerin varlığı ile öne çıkan) tasarımı ve geliştirilmesinden de ilgili ilerlemeler beklenmektedir. Öte yandan, ECM'deki farklı hücre popülasyonlarının neden olduğu değişiklikleri izlemek ve bu bilgiyi dinamik ve fenotipik analizlere dahil etmek için stratejiler tanımlamak da kritik öneme sahiptir.

Veri yönetimi
Klinik bir iş akışında tümör çip üstü tekniklerin konuşlandırılmasına giden yol, çeşitli yönlerde gerçekleşen büyük bir deneysel çalışmadan yararlanacaktır. Çip üzerinde organ modelleri, birçok in vitro teknik gibi, en azından potansiyel olarak, yüksek verimli / yüksek içerikli ölçümler yapmak için işlevseldir. Pozitif ve negatif kontroller ve teknik/biyolojik replikalar dahil olmak üzere deneysel koşulların paralelleştirilmesi, aynı plakaya birkaç çipin entegre edilmesiyle mümkün olmaktadır. Kantitatif verimdeki artış, bu sistemlerin immünoterapiler için hızlı ilaç veya gen tarama boru hattında çevrilmesinde ve doğrulanmasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Gerçekten de, birkaç şirket zaten çok kuyulu bir formatta platformlar geliştirmiştir ve aynı anda çok sayıda cihazın izlenmesine izin vermek için farklı görüntüleme yaklaşımları test edilmektedir14. Yukarıda açıklanan protokollerde, standart bir mikroskop çoklu slayt tepsisi kullanarak, paralel olarak 12 adede kadar deneysel koşulu görselleştirme imkanı ile 3 çipe kadar tahsis eden mikroskop slaytları kullandık. Bu kurulum, el pipetleme ile uyumludur ve mikrofabrikasyon tesisimizde gerçekleştirilen özel odaklı ayarlamalar için uygundur. Aksine, güçlü bir paralelleştirme gerektiğinde (çoklu tarama testleri ve kontrolleri), daha yüksek bir otomasyon seviyesi ayarlamak için kurulum optimizasyonları (yani, pipetleme robotlarının, plastik çoklu kuyuların kullanımı) gereklidir.

Deneyleri tasarlarken, uzamsal ve zamansal çözünürlük arasındaki bir denge dikkate alınmalıdır.

Yüksek içerikli mikroskopi ile üretilen büyük miktarda veri, depolama, aktarma ve analiz açısından sınırlayıcı bir faktör oluşturmaktadır. Bu sorunlar, makine öğrenimi araçlarını ve donanım / yazılım kaynaklarını uygulayan hesaplamalı yaklaşımlarla ele alınmaktadır; bu, terapötik stratejilerin seçiminde çip üstü / in-silico deneyleri67,68'i bağlama olasılığını teşvik edebilir ve bu da iddialı ancak ertelenemez bir fırsatı temsil eder.

Floresan Görüntülemenin Ötesinde
Floresan etiketleme, boyalar veya muhabir genler tarafından, yüksek özgüllüğü nedeniyle, şüphesiz ortak kültür koşullarında farklı hücre popülasyonlarını tanımlamak ve moleküler özellikleri yüksek SNR ile çözmek için altın standart yöntemi temsil eder. OOC modellerinde bu yaklaşım yaygın olarak referans olarak kullanılır ve özellikle heterojen çip üstü tümör mikro ortamlarında, sızan ve etkileşime giren bağışıklık hücrelerinin fenotipini karakterize etmek değerli olabilir.

Bununla birlikte, floroforların, zahmetli boyama prosedürlerinin ve aydınlatma rutinlerinin neden olduğu etkilerin izlenmesi ve en aza indirilmesi gerektiğine dair kanıtlar artmaktadır69 çünkü hücre davranışını derinden etkileyebilir ve70,71 durumunu etkileyebilir. Bu risk, bağışıklık hücreleri gibi kırılgan sistemler için özellikle doğru görünmektedir72,73. Fototoksik reaksiyonlar, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte izlendiğinde canlı hücrelerin zamansal pencere kazanımını tanımlamada sınırlamalar getirebilir. Dahası, çeşitli bağışıklık alt popülasyonlarındaki zenginlik, mikroskoplarda yaygın olarak bulunan sınırlı sayıda filtre göz önüne alındığında, aralarında yalnızca floresan boyama ile ayrım yapmayı imkansız kılmaktadır.

Bu konuyu ele almak için, araçsal bir bakış açısıyla, holografik56 veya hiperspektral mikroskopi57 gibi yeni etiketsiz74 mikroskopi teknikleri şimdi sahnede ortaya çıkıyor. Floresanın ötesinde gelişmiş hücresel süreç sınıflandırma stratejileri vaat ediyorlar ve hassas numuneleri incelemek için özellikle değerli olabilirler. Veri analizi açısından bakıldığında, derin öğrenme algoritmalarına dayanan gelişmiş hesaplama yaklaşımları75 (floresan görüntü veri kümeleri tarafından eğitilmiş), "in silico etiketleme"76,77 olarak adlandırılan işlemi gerçekleştirmek için kapı açıcılardır. Parlak alan görüntülerinden floresan belirteçleri tahmin etmekiçin başarıyla uygulanmışlardır 78, hücreleri boyamadan etiketli görüntüler üreterek, böylece parlak alan mikroskobu bilgilendirme gücünü arttırırlar. Bu strateji, diğer belirteçler için zamandan ve floresan kanallarından tasarruf etmek için de yararlı olabilir. OOC topluluğunun, hücre popülasyonları etkileşiminin daha az invaziv bir çalışmasına izin veren bu yeni tekniklerden yararlanacağına inanıyoruz.

Veri analizi
İmmün ve hedef kanser hücreleri arasındaki etkileşim mekanizmaları, hücre hareketlerinin izlenmesi yoluyla araştırılabilir 28,79. Karmaşık ve heterojen ortak kültürlerdeki hızlandırılmış izleme deneyleri, hücre göç modellerini, morfolojik ve durum değişikliklerini ve kapsamlı soy bilgilerini çıkarmak için son derece değerlidir. Manuel analiz yapmak pratik olarak yalnızca az hücreli kısa diziler için mümkündür, ancak yüksek verimli, sistematik deneyler için mümkün değildir. Sonuç olarak, hücre izleme için tamamen veya kısmen otomatik olarak hesaplama araçlarının geliştirilmesi, görüntü analizinde hayati bir araştırma alanıdır24. Tipik olarak, geleneksel hücre izleme, birçok deneysel koşulda zor olabilen segmentasyon görevlerini doğru bir şekilde gerçekleştirmek için nispeten yüksek örnekleme sıklığı ve uzamsal çözünürlük gerektirir. Hücreleri yerelleştirmek için, bu protokolde veya özel mülk yazılımda sunulduğu gibi açık erişimli segmentasyon ve izleme araçları (örneğin, ImageJ yazılımı22) mevcuttur. Büyük ölçekli çalışmalarda, Roma'daki Tor Vergata Üniversitesi tarafından geliştirilen Cell Hunter16,31 adlı tescilli bir yazılımı, kanser ve bağışıklık hücrelerini çok popülasyonlu bağlamda tam otomatik bir şekilde ayırt etmek için uyguladık. Makine öğrenimi ve Sinir ağı yaklaşımlarına dayanan özel çözümler 80,81,82 bugün SNR'nin iyileştirilmesinden kritik edinim parametrelerinin veya segmentasyon adımlarının yönetilmesine kadar mikroskopi yazılım paketleri 83'te uygulanmaya başlanmıştır. Makine öğrenimi, mikroçevresel faktörlere göre biyolojik tepkiyi karakterize etmek için ortak hücresel kalıpları (örneğin, hareket stilleri) tanımak için kullanılabilir.

Comes ve ark.41'de, kanser hücrelerinin bir ilaç tedavisine maruz kalıp kalmadığını sınıflandırmak için önceden eğitilmiş bir Derin Öğrenme Evrişimli Sinir Ağı mimarisi, mikrocihazlardaki kollajen matrislerinde meme kanseri hücrelerinin ve PBMC'lerin ko-kültürlerinin zaman atlamalı verilerinden izlenen bağışıklık hücrelerinin hareketliliğini bir "belirteç" olarak kullanarak sınıflandırmak için uygulanmıştır. 33'te açıklandığı gibi.

Tek hücreli omik yöntemler ve ontolojilerin geliştirilmesi
Tek hücreli omik teknolojiler84 (örneğin, proteomik, metabolomik, genomik) ve çip üstü yöntemler arasında stratejik bir ittifaka duyulan ihtiyaca işaret ediyoruz: fonksiyonel dinamik bilgiye konjuge edilen moleküler ayrıntılı karakterizasyon, temel mekanizmaların ve klinik tanımlamanın anlaşılmasını artırabilir. Bu durumda, iki dünyayı birbirine bağlamak için yeni araçlar başlangıçlarındadır85. İlk zorluk, tek hücreli omik yaklaşımları doğrudan onko-immünoloji çipleri22 üzerinde uygulamaktır. Dahası, çip üzerindeki organlar, genomik ve proteomik analizler tarafından belirlenen potansiyel hedefleri test etmek için platformlar olarak kullanılabilir86,87. Hala büyük ölçüde eksik olan ikinci bir bağlantı aracı, ölçülen sistem sonuçlarına açıklama eklemenin ve depolamanın yapılandırılmış, standartlaştırılmış bir yoludur88,89. Ancak gelecekte hücresel nicel sonuçların ve ölçülen özelliklerin sistematik veritabanlarını oluşturmak, bunları doğal biyolojik bilgilerle çıkarmak, çıkarmak ve ilişkilendirmek için ihtiyacımız olan şey tam olarak budur. Kısacası, heterojen deneysel veri kümelerinin standardizasyonuna ve sistematik analizine duyulan ihtiyaç, bir ontoloji çerçevesi gerektirir.

Modelleri kişiselleştirme
Çip üzerinde organlar teknolojisi, kişiselleştirme12 için uygundur, çünkü tek hastalardan (veya hasta sınıflarından) gelen hücreler ve dokular, kontrollü koşullar altında cihazlarda kullanılabilir ve bu da terapötik veya önleme stratejilerini bilgilendirmek için yararlı olan klinik olarak ilgili okumalara yol açar. Bazı örnekler literatürde yer almaya başlıyor90. Tabii ki, çip üzerinde tümör modelleri için, bu zorluk çözülmesi gereken birkaç teknik ve bilimsel soru ortaya çıkarmaktadır36 (oksijen konsantrasyonu, sitokin gradyanları vb. gibi TME özellikleri kontrolü gibi). Daha da önemlisi, onkoloji ve onko-immünoloji tedavilerini daha etkili hale getirme ve her hasta için zararlı etkileri azaltma olasılığı, sağlık kaynaklarının optimizasyonu için yaşam kalitesi açısından caziptir.

Sonuç olarak, bu alanın özgün anlamda disiplinler arası bir alan olduğu ve bu nedenle araştırmacı, klinisyenler, endüstri arasında ortak bir dil ve ortak hedefler oluşturmada büyük çaba gerektirdiği, aynı zamanda farklı disiplinlerden (mühendislik, biyoloji, veri bilimi, tıp, kimya) iyi bir denge ve yeni çözümler bulma konusunda büyük çaba gerektirdiği açıktır91.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok. AS, Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) ve Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273) tarafından desteklenmektedir. GS ve FM, İtalyan Kanser Araştırmaları Derneği (AIRC) no. 21366 tarafından GS'ye kadar desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials 
50 mL tubes Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS430828 centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC Millipore-Sigma; St. Louis, MO A3656 DNA-hypomethylating agent
6-well plates Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS3506 culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask Corning, New York, NY 430641U culture flasks
A365M American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		 human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride Millipore-Sigma; St. Louis, MO D1515 anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0728L Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium EuroClone Spa, Milan, Italy ECB4004L saline buffer solution
Fetal Bovine Serum EuroClone Spa, Milan, Italy ECS0180L ancillary for cell culture
Ficoll GE-Heathcare 17-1440-02 separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometer Neubauer Cell counter
Heparinized vials Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b Millipore-Sigma; St. Louis, MO SRP4595 recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3000D ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media Cedarlane Labs, Burlington, Canada Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel Corning, New York, NY 354230 growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26 human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3001D ancillary for cell culture
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201 Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH26GL red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH67GL green fluorescent cell dye
RPMI-1640 EuroClone Spa, Milan, Italy ECM2001L Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 15250061 cell stain to assess cell viability
Trypsin EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0920D dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator  Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C) FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Steril VBH 72 MP Laminar flow hood
Optical microscope Zeiss
Refrigerable centrifuge Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) Sigma Aldrich A3648 silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ  MB W&A,  Germany optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm) Ibidi, Germany 10812
Hydrogen Peroxide solution 30% Carlo Erba Reagents 412081 reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone Carlo Erba Reagents 461945 PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm  Sail Brand 7101 substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm Tedpella dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa Allresist,Germany AR-P. 679.04 Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips Ibidi, Germany 10813 substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped Gambetti Xenologia Srl, Italy 30255
Propan-2-ol Carlo Erba Reagents 415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Sigma Aldrich 484431-4L SU-8 resists developer
SU-8 3005 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0001 Negative Photoresists
SU-8 3050 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0005 Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm Tedpella 15111-40, 15111-60, 15111-80 dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96% Carlo Erba Reagents 410381 reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dowsil, Dow Corning 11-3184-01 Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS) Sigma Aldrich 92360-100ML silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, Suppl 1 282 (2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235 (2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639 (2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737 (2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450 (2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093 (2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664 (2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985 (2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine - Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789 (2019).
  54. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT - Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014 (2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Nikon. , Available from: http://www.microscope.healthcare.nikon.com/produc (2020).
  84. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  85. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  86. Ingber, D. E. Developmentally inspired human 'organs on chips.'. Development. , Cambridge. (2018).
  87. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  88. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  89. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16 (2019).
  90. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  91. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 170 Çip üzerinde organlar tümör immünolojisi kanser-immün crosstalk tümör mikroçevresi immün konstrüksiyon hücresel dinamikler ve etkileşimler mikroakışkan immüno-yetkin çip üstü tümör immüno-onkoloji hücre takibi
İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Ninno, A., Bertani, F. R.,… More

De Ninno, A., Bertani, F. R., Gerardino, A., Schiavoni, G., Musella, M., Galassi, C., Mattei, F., Sistigu, A., Businaro, L. Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments. J. Vis. Exp. (170), e61895, doi:10.3791/61895 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter