3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi
Summary
Burada bir küresel görüntüleme cihazının üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu cihaz kanser hücre sferoidlerinin dinamik veya boyuna floresan görüntülemesini sağlar. Protokol ayrıca kanser hücre invazyonunun analizi için basit bir görüntü işleme prosedürü sunmaktadır.
Abstract
Birincil tümörden kanser hücrelerinin bitişik sağlıklı dokulara istilası metastazda erken bir adımdır. İnvaziv kanser hücreleri büyük bir klinik zorluk oluşturur, çünkü yayılmaları başladıktan sonra ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem yoktur. Kanser hücre invazyonunu düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine yol açabilir. Tümörlere fizyolojik benzerlikleri nedeniyle, kollajene gömülü sferoidler, kanser hücresi istilasını hücre dışı matrise (ECM) yöneten mekanizmaları incelemek için araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu test (1) küresellerin ECM’ye gömülmesi üzerinde kontrol eksikliği ile sınırlıdır; (2) kollajen I ve cam alt yemeklerin yüksek maliyeti, (3) antikorların ve floresan boyaların verimsiz penetrasyonu ve (4) verilerin zaman alıcı görüntü işlemesi ve nicelemesi nedeniyle güvenilmez immünofluoresan etiketleme. Bu zorlukları ele almak için, üç boyutlu (3D) küresel protokolü, kollajen I’e gömülü floresan etiketli kanser hücrelerini zaman atlamalı videolar veya boyuna görüntüleme kullanarak görüntülemek ve kanser hücresi istilasını analiz etmek için optimize ettik. İlk olarak, sferoidleri güvenilir bir şekilde ve minimal bir kollajen I hacmine gömmek için bir küresel görüntüleme cihazının (SID) imalatını tarif ediyoruz ve test maliyetini azaltıyoruz. Daha sonra, canlı ve sabit küresellerin sağlam floresan etiketlemesi için adımları tanımlamaktadır. Son olarak, görüntü işleme ve veri nicelemesi için kullanımı kolay bir Fiji makrosu sunuyoruz. Tamamen, bu basit metodoloji kollajen I’de kanser hücresi invazyonunu izlemek için güvenilir ve uygun fiyatlı bir platform sağlar. Ayrıca, bu protokol kullanıcıların ihtiyaçlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir.
Introduction
Kanserin ilerlemesi sırasında, kanser hücreleri hareketli ve invaziv bir fenotip elde edebilir, tümör kütlesinden kaçmalarını ve çevre dokulara istila etmelerini sağlar1. Sonunda, bu invaziv kanser hücreleri ikincil organların içine ulaşabilir ve büyüyebilir, kanser metastazı1. Metastaz kansere bağlı ölümlerin% 90’ından fazla neden olur2. Bunun bir nedeni, lokalize tümörler klinik olarak yönetilebilir olsa da, metastatik yayılma meydana geldikten sonra invaziv kanser hücrelerinin ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem bulunmamasıdır. Bu nedenle, invaziv kanser hücrelerinin ortaya çıkması ve lokalize bir hastalıktan invaziv bir hastalığa geçiş büyük bir klinik zorluk oluşturmaktadır. Kanser hücrelerinin invaziv bir davranışı nasıl başlattığını ve sürdürdüğünü belirlemek, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine neden olabilir.
3D küresel model, kontrollü, ancak fizyolojik olarak ilgili koşullar altında kanser hücrelerinin hareketli davranışlarını araştırmak için ideal bir platformdur3. Gerçekten de, bu testte, kanser hücrelerinin küreselleri hücre dışı matrisin (ECM), örneğin basitleştirilmiş bir tümörü taklit eden kollajen I’in içine gömülür. Daha sonra, görüntüleme, kanser hücrelerinin sferoidden kollajen matrisine invazyonunun görselleştirilmesi için kullanılır. Ancak, birden çok zorluk bu yordamı sınırlar.
İlk zorluk, sıvı kollajen matrisinin çanak yüzeyine yayılabileceği ve küreselin yemeğin dibine dokunmasına neden olan gömme adımında gerçekleşir. Sonuç olarak, küreselden gelen hücreler iki boyutlu (2D) yüzeye yayılır ve üç boyutlu (3D) küresel morfolojiyi kırır. Kollajen hacmini artırmak verimli, ancak maliyetli bir çözümdür. Hücrelerin 2D yüzeye yayılmasını önlemek için, minimum miktarda kollajen korurken, 1 mm kalınlığında, 3 delikli bir polidimetilsiloksan (PDMS) kesici ucu cam bir alt kabın üzerine bağlayarak bir küresel görüntüleme cihazı (SID) geliştirdik.
Küresel testin ikinci zorluğu, sferoid boyutu ile artan bir etki olan antikorların ve floresan boyaların zayıf penetrasyonu ile sınırlı olan sferoidlerdeki kanser hücrelerinin etiketlenilmesidir. Hücreleri etiketlemek için ideal çözüm, floresan proteinleri(leri) kasten ifade eden hücre hatlarının kurulması olsa da, bu seçenek çoğunlukla ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarıyla sınırlıdır ve floresan protein chimeras mevcudiyeti ile sınırlıdır. Burada, sabit sferoidlerin immünofluoresans boyanmasının yanı sıra, küreseli gömmeden hemen önce hücreleri etiketlemek için sitoplazmik bir boyanın verimli kullanımı için optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz.
Küresel testlerin üçüncü zorluğu, zaman içinde hücre istilasının yarı otomatik ölçülmesi için basit Fiji makrolarının olmamasıdır. Bu zorluğu ele almak için, zaman içinde küresel alanı analiz etmek için basit bir metodoloji açıklıyoruz. Örnek olarak 4T1 ve 67NR hücre çizgilerini kullanarak bu protokolün avantajlarını gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D baskılı aralayıcı, deneysel uygulamaların gerektirdiği şekilde, pdms’nin çeşitli şekillerini kolayca oluşturmak için kullanılabilecek 1 mm kalınlığında PDMS sayfaları oluşturmak için tasarlanmıştır. İmalatının basitliği ve tasarımı değiştirme özgürlüğü nedeniyle, SID’nin ilk tasarımı için bu PDMS döküm yöntemi seçildi. Yüksek hacimli SID’ler gerekiyorsa, zaten üç eşit aralıklı deliği olan PDMS diskleri içeren 3D baskılı bir kalıp oluşturularak ve işlem tek adıma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Temple Bioengineering üyelerine değerli tartışmalar için teşekkür ederiz. Akış sitometri çekirdeğinden (Lewis Katz Tıp Fakültesi) David Ambrose’a hücre ayıklama konusundaki yardımı için ve IDEAS Hub’dan (Mühendislik Koleji, Temple Üniversitesi) Tony Boehm’e 3D baskı konusunda yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca finansman kaynaklarımıza da teşekkür ediyoruz: Amerikan Kanser Derneği Araştırma Bursiyeri Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Genç Araştırmacı Ödülü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, R00 CA172360 ve R01 CA230777, hepsi BG’ye.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
