Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.
Abstract
La invasión de células cancerosas del tumor primario a los tejidos sanos adyacentes es un paso temprano en la metástasis. Las células cancerosas invasivas plantean un gran desafío clínico porque no existe ningún método eficiente para su eliminación una vez que su diseminación está en marcha. Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan la invasión de células cancerosas puede conducir al desarrollo de nuevas terapias potentes. Debido a su parecido fisiológico con los tumores, esferoides incrustados en colágeno he sido ampliamente utilizado por los investigadores para estudiar los mecanismos que rigen la invasión de células cancerosas en la matriz extracelular (ECM). Sin embargo, este ensayo está limitado por 1) la falta de control sobre la incrustación de esferoides en el ECM; (2) alto costo de los platos inferiores de colágeno I y vidrio, (3) etiquetado inmunofluorescente poco fiable, debido a la penetración ineficiente de anticuerpos y colorantes fluorescentes y (4) procesamiento de imágenes que consume mucho tiempo y cuantificación de los datos. Para hacer frente a estos desafíos, optimizamos el protocolo esferoide tridimensional (3D) para crear imágenes de células cancerosas etiquetadas fluorescentemente incrustadas en el colágeno I, ya sea usando videos de lapso de tiempo o imágenes longitudinales, y analizamos la invasión de células cancerosas. En primer lugar, describimos la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides (SID) para incrustar esferoides de forma fiable y en un volumen mínimo de colágeno I, reduciendo el costo del ensayo. A continuación, delineamos los pasos para el etiquetado robusto de fluorescencia de esferoides vivos y fijos. Por último, ofrecemos una macro de Fiji fácil de usar para el procesamiento de imágenes y la cuantificación de datos. En conjunto, esta metodología simple proporciona una plataforma confiable y asequible para monitorear la invasión de células cancerosas en el colágeno I. Además, este protocolo se puede modificar fácilmente para adaptarse a las necesidades de los usuarios.
Introduction
Durante la progresión del cáncer, las células cancerosas pueden adquirir un fenotipo motil e invasivo, lo que les permite escapar de la masa tumoral e invadir los tejidos circundantes1. Con el tiempo, estas células cancerosas invasivas pueden alcanzar y crecer dentro de órganos secundarios, un proceso llamado metástasis del cáncer1. La metástasis causa más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer2. Una de las razones de esto es que, si bien los tumores localizados son clínicamente manejables, no existen métodos eficientes para la eliminación de las células cancerosas invasivas una vez que se ha producido la propagación metastásica. Por lo tanto, la aparición de células cancerosas invasivas y la transición de una enfermedad localizada a una enfermedad invasiva está planteando un gran desafío clínico. Determinar cómo las células cancerosas inician y sostienen un comportamiento invasivo puede conducir al desarrollo de nuevas terapias potentes.
El modelo esferoide 3D es una plataforma ideal para investigar el comportamiento motil de las células cancerosas bajo control, pero condiciones fisiológicamente relevantes3. De hecho, en este ensayo, los esferoides de las células cancerosas están incrustados dentro de la matriz extracelular (ECM), por ejemplo el colágeno I, que imita un tumor simplificado. A continuación, las imágenes se utilizan para visualizar la invasión de las células cancerosas del esferoide a la matriz del colágeno. Sin embargo, varios desafíos limitan este procedimiento.
El primer desafío se produce en el paso de incrustación, donde la matriz de colágeno líquido puede extenderse a través de la superficie del plato, haciendo que el esferoide toque la parte inferior del plato. En consecuencia, las células del esferoide se propagan en la superficie bidimensional (2D), rompiendo la morfología esferoide tridimensional (3D). Aumentar el volumen de colágeno es una solución eficiente, pero costosa. Para evitar que las células se propaguen en la superficie 2D, manteniendo un volumen mínimo de colágeno, desarrollamos un dispositivo de imágenes esferoides (SID) delimitando un inserto de polidimetilesiloxano (PDMS) de 1 mm de espesor y 3 agujeros en un plato inferior de vidrio.
El segundo desafío del ensayo esferoide es el etiquetado de las células cancerosas en esferoides, que está limitado por la mala penetración de anticuerpos y colorantes fluorescentes, un efecto que aumenta con el tamaño del esferoide. Si bien la solución ideal para etiquetar células es el establecimiento de líneas celulares que expresan permanentemente proteínas fluorescentes, esta opción se limita principalmente a líneas celulares inmortalizadas y está limitada por la disponibilidad de quimeras de proteína fluorescente. Aquí, describimos un protocolo optimizado para la tinción de inmunofluorescencia de esferoides fijos, así como el uso eficiente de un tinte citoplasmático para etiquetar las células inmediatamente antes de incrustar el esferoide.
El tercer desafío del ensayo esferoide es la falta de macros simples de Fiji para la cuantificación semiautomática de la invasión celular con el tiempo. Para abordar este desafío, describimos una metodología sencilla para analizar el área esferoide a lo largo del tiempo. Ilustramos las ventajas de este protocolo utilizando las líneas celulares 4T1 y 67NR como ejemplos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El espaciador impreso en 3D fue diseñado para crear láminas de 1 mm de grosor de PDMS que luego se pueden utilizar para crear fácilmente varias formas de PDMS, según lo requieran las aplicaciones experimentales. Debido a la simplicidad de su fabricación y la libertad de alterar el diseño, este método de fundición PDMS fue elegido para el diseño inicial del SID. Si se requiere un alto volumen de SIDs, la producción se puede hacer más eficiente mediante la creación de un molde impreso en 3D, que ya contiene dis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a los miembros de La Bioingeniería del Templo por sus valiosos debates. Agradecemos a David Ambrose en el núcleo de citometría de flujo (Lewis Katz School of Medicine) por su asistencia con la clasificación celular y a Tony Boehm del CENTRO IDEAS (College of Engineering, Temple University) por su ayuda con la impresión 3D. También agradecemos nuestros recursos de financiación: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 y R01 CA230777, todo a BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
