Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Bildgebung und Analyse der Krebszellinvasion im 3D-Sphäroid-Modell
Summary
Hier wird ein Protokoll für die Herstellung eines sphäroiden Bildgebungsgeräts vorgestellt. Dieses Gerät ermöglicht eine dynamische oder Längsfluoreszenzbildgebung von Krebszellsphäroiden. Das Protokoll bietet auch ein einfaches Bildverarbeitungsverfahren für die Analyse der Krebszellinvasion.
Abstract
Die Invasion von Krebszellen aus dem Primärtumor in das angrenzende gesunde Gewebe ist ein früher Schritt in der Metastasierung. Invasive Krebszellen stellen eine große klinische Herausforderung dar, da es keine effiziente Methode für ihre Eliminierung gibt, sobald ihre Verbreitung im Gange ist. Ein besseres Verständnis der Mechanismen zur Regulierung der Krebszellinvasion kann zur Entwicklung neuartiger potenter Therapien führen. Aufgrund ihrer physiologischen Ähnlichkeit mit Tumoren, Sphäroide in Kollagen eingebettet I wurden ausgiebig von Forschern verwendet, um die Mechanismen für die Invasion von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix (ECM) zu untersuchen. Dieser Test wird jedoch durch (1) einen Mangel an Kontrolle über die Einbettung von Spheroiden in das ECM begrenzt; (2) hohe Kosten für Kollagen-I- und Glasbodenschalen, (3) unzuverlässige immunfluoreszierende Kennzeichnung aufgrund des ineffizienten Eindringens von Antikörpern und Fluoreszenzfarbstoffen und (4) zeitaufwändige Bildverarbeitung und Quantifizierung der Daten. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir das dreidimensionale (3D) Sphäroidprotokoll optimiert, um fluoreszierend markierte Krebszellen, die in Kollagen I eingebettet sind, entweder mithilfe von Zeitraffervideos oder Längsbildgebung abzubilden und die Invasion von Krebszellen zu analysieren. Zunächst beschreiben wir die Herstellung eines Sphäroid-Bildgebungsgeräts (SID), um Sphäroide zuverlässig und in ein minimales Kollagen-I-Volumen einzubetten, wodurch die Assay-Kosten gesenkt werden. Als Nächstes zeichnen wir die Schritte zur robusten Fluoreszenzkennzeichnung von lebenden und festen Sphäroiden ab. Schließlich bieten wir ein einfach zu bedienendes Fidschi-Makro für die Bildverarbeitung und Datenquantifizierung. Insgesamt bietet diese einfache Methode eine zuverlässige und erschwingliche Plattform, um die Krebszellinvasion in Kollagen I zu überwachen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll leicht an die Bedürfnisse der Benutzer angepasst werden.
Introduction
Während der Krebsprogression können Krebszellen einen motilen und invasiven Phänotyp erwerben, der es ihnen ermöglicht, der Tumormasse zu entkommen und in das umgebende Gewebe einzudringen1. Schließlich können diese invasiven Krebszellen in sekundären Organen erreichen und wachsen, ein Prozess namens Krebsmetastasierung1. Metastasen verursachen mehr als 90% der krebsbedingten Todesfälle2. Ein Grund dafür ist, dass, während lokalisierte Tumoren klinisch überschaubar sind, keine effizienten Methoden zur Eliminierung invasiver Krebszellen existieren, sobald eine metastasierende Ausbreitung stattgefunden hat. Daher stellt das Auftreten invasiver Krebszellen und der Übergang von einer lokalisierten zu einer invasiven Krankheit eine große klinische Herausforderung dar. Die Bestimmung, wie Krebszellen ein invasives Verhalten initiieren und aufrecht erhalten, kann zur Entwicklung neuartiger potenter Therapien führen.
Das 3D-Sphäroidmodell ist eine ideale Plattform, um das motile Verhalten von Krebszellen unter kontrollierten, aber physiologisch relevanten Bedingungen zu untersuchen3. Tatsächlich werden in diesem Test Sphäroide von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet, zum Beispiel Kollagen I, das einen vereinfachten Tumor imitiert. Dann wird die Bildgebung verwendet, um die Invasion von Krebszellen aus dem Sphäroid in die Kollagenmatrix zu visualisieren. Mehrere Herausforderungen schränken dieses Verfahren jedoch ein.
Die erste Herausforderung tritt bei der Einbettungsstufe auf, wo sich die flüssige Kollagenmatrix über die Telleroberfläche ausbreiten kann, wodurch das Sphäroid den Boden der Schale berührt. Folglich breiten sich Zellen aus dem Sphäroid auf der zweidimensionalen (2D) Oberfläche aus und brechen die dreidimensionale (3D) Sphäroidmorphologie. Die Erhöhung des Kollagenvolumens ist eine effiziente, aber kostspielige Lösung. Um zu verhindern, dass sich Zellen auf der 2D-Oberfläche ausbreiten und gleichzeitig ein minimales Kollagenvolumen beibehält, haben wir ein Sphäroid-Bildgebungsgerät (SID) entwickelt, indem wir einen 1 mm dicken 3-Loch-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Einsatz auf eine Glasbodenschale begrenzt haben.
Die zweite Herausforderung des Sphäroid-Assays ist die Kennzeichnung von Krebszellen in Sphäroiden, die durch das schlechte Eindringen von Antikörpern und fluoreszierenden Farbstoffen begrenzt wird, ein Effekt, der mit der Sphäroidgröße zunimmt. Während die ideale Lösung für die Kennzeichnung von Zellen die Etablierung von Zelllinien ist, die fluoreszierende Proteine stabil ausdrücken, ist diese Option meist auf verewigte Zelllinien beschränkt und durch die Verfügbarkeit von fluoreszierenden Proteinchimären begrenzt. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung von festen Sphäroiden sowie die effiziente Verwendung eines zytoplasmatischen Farbstoffs zur Kennzeichnung von Zellen unmittelbar vor dem Einbetten des Sphäroids.
Die dritte Herausforderung des Sphäroid-Assays ist das Fehlen einfacher Fidschi-Makros für die halbautomatische Quantifizierung der Zellinvasion im Laufe der Zeit. Um dieser Herausforderung zu begegnen, beschreiben wir eine einfache Methode, um den Sphäroidbereich im Laufe der Zeit zu analysieren. Wir veranschaulichen die Vorteile dieses Protokolls anhand der Zelllinien 4T1 und 67NR als Beispiele.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der 3D-gedruckte Abstandsraum wurde entwickelt, um 1 mm dicke Blätter von PDMS zu erstellen, die dann verwendet werden können, um einfach verschiedene Formen von PDMS zu erstellen, wie es von den experimentellen Anwendungen gefordert wird. Aufgrund der Einfachheit der Fertigung und der Freiheit, das Design zu ändern, wurde diese Methode des PDMS-Castings für das ursprüngliche Design der SID gewählt. Wenn ein hohes SID-Volumen erforderlich ist, kann die Produktion effizienter gestaltet werden, indem eine 3D-gedruckt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern von Temple Bioengineering für wertvolle Diskussionen. Wir danken David Ambrose vom Flow Cytometry Core (Lewis Katz School of Medicine) für seine Unterstützung bei der Zellsortierung und Tony Boehm vom IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) für die Hilfe beim 3D-Druck. Wir danken auch unseren Fördergeldern: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 und R01 CA230777, alle an BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
Riferimenti
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