Her præsenterer vi en protokol til at undersøge virkningerne af hydraulisk frakturering på nærliggende vandløb ved at analysere deres vand- og sedimentmikrobielle samfund.
Hydraulisk frakturering (HF), almindeligvis kaldet “fracking”, bruger en blanding af højtryksvand, sand og kemikalier til at fraktur klipper, frigive olie og gas. Denne proces revolutionerede den amerikanske energiindustri, da den giver adgang til ressourcer, der tidligere var uopnåelige og nu producerer to tredjedele af den samlede naturgas i USA. Selv om fracking har haft en positiv indvirkning på den amerikanske økonomi, flere undersøgelser har fremhævet dens skadelige miljømæssige virkninger. Af særlig bekymring er virkningen af fracking på hovedvandsstrømme, som er særligt vigtige på grund af deres uforholdsmæssigt store indvirkning på sundheden for hele vandskel. Bakterierne i disse vandløb kan bruges som indikatorer for strøm sundhed, som bakterierne til stede og deres overflod i en forstyrret strøm forventes at afvige fra dem i en ellers sammenlignelig, men uforstyrret strøm. Derfor har denne protokol til formål at bruge bakteriesamfundet til at afgøre, om vandløb er blevet påvirket af fracking. Med henblik herpå skal der opsamles sediment- og vandprøver fra vandløb nær fracking (potentielt påvirket) og opstrøms eller i et andet vandskel af frackingaktivitet (upimpacted). Disse prøver er derefter udsat for nukleinsyre udvinding, bibliotek forberedelse, og sekventering at undersøge mikrobielle samfund sammensætning. Korrelationsanalyse- og maskinlæringsmodeller kan efterfølgende anvendes til at identificere, hvilke funktioner der er explanative af variation i samfundet, samt identifikation af prædiktive biomarkører for frackings virkning. Disse metoder kan afsløre en række forskelle i de mikrobielle samfund blandt headwater vandløb, baseret på nærheden til fracking, og tjene som grundlag for fremtidige undersøgelser af de miljømæssige konsekvenser af fracking aktiviteter.
Hydraulisk frakturering (HF), eller “fracking”, er en metode til udvinding af naturgas, som er blevet mere og mere udbredt, da efterspørgslen efter fossile brændstoffer fortsætter med at stige. Denne teknik består i at bruge høj-drevne boreudstyr til at injicere en blanding af vand, sand og kemikalier i metan-rige skifer aflejringer, normalt at frigive fanget gasser1.
Da disse ukonventionelle høstteknikker er relativt nye, er det vigtigt at undersøge virkningerne af en sådan praksis på nærliggende vandveje. Fracking aktiviteter mandat clearing af store skår af jord til transport af udstyr og brønd pad konstruktion. Ca. 1,2-1,7 hektar jord skal ryddes for hver brønd pad2, potentielt påvirker afstrømning og vandkvalitet af systemet3. Der er mangel på gennemsigtighed omkring den nøjagtige kemiske sammensætning af frackingvæske, herunder hvilke biocider der anvendes. Derudover har fracking spildevand tendens til at være meget saltvand2. Desuden kan spildevandet indeholde metaller og naturligt forekommende radioaktive stoffer2. Derfor er muligheden for lækager og spild af frackingvæske på grund af menneskelige fejl eller udstyrsfejl bekymrende.
Vandløbsøkosystemer er kendt for at være meget følsomme over for ændringer i de omkringliggende landskaber4 og er vigtige for at bevarebiodiversiteten 5 og korrekt næringsstofcykling6 inden for hele vandskel. Mikrober er de mest rigelige organismer i ferskvandsstrømme og er derfor afgørende for næringsstofcykling, bionedbrydning og primærproduktion. Mikrobielle samfund sammensætning og funktion tjene som gode værktøjer til at få oplysninger om økosystemet på grund af deres følsomhed over for forstyrrelser, og nyere forskning har vist forskellige skift i observerede bakterielle assemblages baseret på nærhed til fracking aktivitet7,8. For eksempel blev Beijerinckia, Burkholderiaog Methanobacterium identificeret som beriget i vandløb nær fracking, mens Pseudonocardia, Nitrospiraog Rhodobacter blev beriget i vandløbene ikke i nærheden af fracking7.
Næste generation sekventering af 16S ribosomal RNA (rRNA) genet er en overkommelig metode til bestemmelse af bakterielle samfund sammensætning, der er hurtigere og billigere end hele genom sekventering tilgange9. En almindelig praksis inden for molekylær økologi er at bruge den meget variable V4-region i 16S rRNA-genet til sekventeringsopløsning, ofte ned til slægtsniveauet med et bredt identifikationsområde9, da det er ideelt til uforudsigelige miljøprøver. Denne teknik er blevet implementeret bredt i offentliggjorte undersøgelser og er med succes blevet udnyttet til at identificere virkningen af fracking operationer på vandmiljøer7,8. Det er dog værd at bemærke, at bakterier har varierende kopinumre af 16S rRNA-genet, som påvirker deres påviste overflod10. Der er et par værktøjer til at tage højde for dette, men deres effektivitet er tvivlsom10. En anden praksis, der hurtigt vokser i prævalens og mangler denne svaghed er metatranscriptom sekventering, hvor alle RNA er sekventeret, så forskerne kan identificere både aktive bakterier og deres gener udtryk.
I modsætning til metoder i tidligere offentliggjorte undersøgelser7,8,11,12omfatter denne protokol derfor også prøvesamling, konservering, behandling og analyse til undersøgelse af mikrobiel fællesskabsfunktion (metatranscriptomics). De trin, der er beskrevet heri, gør det muligt for forskere at se, hvilken indvirkning, hvis nogen, fracking har haft på de gener og veje udtrykt af mikrober i deres vandløb, herunder antimikrobielle resistensgener. Desuden forbedres detaljeringsniveauet for prøveindsamling. Selv om flere af de trin og noter kan synes indlysende for erfarne forskere, de kunne være uvurderlige for dem, der lige er begyndt forskning.
Heri beskriver vi metoder til indsamling og behandling af prøver til at generere bakterielle genetiske data som et middel til at undersøge virkningen af fracking på nærliggende vandløb baseret på vores laboratoriers mange års erfaring. Disse data kan bruges i downstream-applikationer til at identificere forskelle svarende til fracking status.
De metoder, der er beskrevet i dette papir, er udviklet og raffineret i løbet af flere undersøgelser offentliggjort af vores gruppe mellem 2014 og 20187,8,10 og er blevet anvendt med succes i et samarbejdsprojekt for at undersøge virkningerne af fracking på vandsamfund i et treårigt projekt, der snart vil indsende et papir til offentliggørelse. Disse metoder vil fortsat blive anvendt i løbet af resten af projektet. Derudover beskriver andre aktuelle litteraturer, der undersøger virkningen af fracking på vandløb og økosystemer, lignende metoder til indsamling, behandling og analyse af stikprøver7,8,10,11. Men ingen af disse papirer udnyttet metatranscriptomic analyse, hvilket gør dette papir den første til at beskrive, hvordan disse analyser kan bruges til at belyse fracking indvirkning på nærliggende vandløb. Desuden er de metoder, der præsenteres her til prøveindsamling, mere detaljerede, og det samme gælder de skridt, der er taget for at undgå forurening.
Et af de vigtigste trin i vores protokol er indledende prøve indsamling og bevarelse. Feltudtagning og -indsamling kommer med visse udfordringer, da det kan være svært at opretholde et aseptisk eller sterilt miljø under indsamlingen. I løbet af dette trin er det vigtigt at undgå at forurene prøver. For at gøre dette skal handsker bæres, og kun sterile beholdere og værktøjer skal have lov til at komme i kontakt med prøver. Prøver bør også straks placeres på is efter indsamling for at afbøde nedbrydning af nukleinsyre. Tilføjelse af et kommercielt nukleinsyrebeskyttelsesmiddel ved indsamling kan også øge nukleinsyreudbyttet og tillade, at prøverne opbevares i længere tid efter indsamlingen. Når nukleinsyreudvinding udføres, er det vigtigt at bruge den passende mængde prøve, for meget kan tilstoppe spinfiltre, der bruges til ekstraktion (til de protokoller, der gør brug af dem), men for lidt kan resultere i lave udbytter. Sørg for at følge instruktionerne for det sæt, der bruges.
I lighed med feltindsamling er det også vigtigt at undgå eller minimere forurening under udvinding af nukleinsyre og prøveforberedelse, især når der arbejdes med prøver med lavt nukleinsyreudbytte, såsom suboptimal sedimentprøver (prøver, der indeholder en stor mængde grus eller sten) eller vandprøver. Derfor, som med prøveopsamling, handsker bør bæres under alle disse trin for at reducere forureningen. Derudover skal alle arbejdsflader, der anvendes under laboratorieprocedurer, steriliseres på forhånd ved at tørre med en 10% blegemiddelopløsning efterfulgt af en 70% ethanolopløsning. For pipetteringstrin (3-6) skal filterspidser anvendes for at undgå forurening på grund af selve pipetten, hvor spidserne ændres, hver gang de rører ved en ikke-steril overflade. Alle værktøjer, der anvendes til laboratoriearbejde, herunder pipetter, skal tørres ned før og efter med blegemiddel og ethanolopløsninger. For at vurdere kontaminering bør ekstraktionsemner og negativer (steril væske) medtages under hvert sæt nukleinsyreudtræk og PCR-reaktioner. Hvis kvantificering efter ekstraktioner afslører en påviselig mængde DNA/RNA i negativerne, kan ekstraktioner gentages, hvis der er tilstrækkelig prøve tilbage. Hvis negative prøver til PCR viser forstærkning, skal der foretages fejlfinding for at bestemme kilden, og derefter skal prøverne genvædes. For at tage højde for lave forureningsniveauer anbefales det, at ekstraktionsemner og PCR-negativer sekvenseres, så kontaminanterne om nødvendigt kan identificeres og fjernes under beregningsanalysen. Omvendt kan PCR-forstærkning også mislykkes på grund af en række årsager. For miljøprøver er hæmning af PCR-reaktionen ofte synderen, hvilket kan skyldes en række stoffer, der forstyrrer Taq polymerase23. Hvis der er mistanke om hæmning, kan pcr-kvalitet vand (se Tabel over materialer)bruges til at fortynde DNA-ekstrakterne.
Denne protokol har et par bemærkelsesværdige begrænsninger og potentielle vanskeligheder. Prøveindsamling kan være udfordrende for både vand- og sedimentprøver. For at få nok biomasse skal der ideelt set skubbes 1 L strømvand gennem et filter. Porerne i filteret skal være små for at fange mikrober, men kan også fælde sediment. Hvis der er meget sediment i vandet på grund af nylig nedbør, kan filteret tilstoppe, hvilket gør det vanskeligt at skubbe hele volumen gennem filteret. For sediment indsamling, kan det være udfordrende at vurdere dybden af sediment under indsamling. Desuden er det vigtigt at sikre, at det indsamlede sediment overvejende er jord, da småsten og klipper vil føre til lavere nukleinsyreudbytte og måske ikke er en nøjagtig repræsentation af det mikrobielle samfund. Endelig er det også vigtigt, at prøver opbevares på is efter indsamling, især hvis der ikke anvendes et konserveringsmiddel.
Selvom denne protokol dækker både metatranscriptomics og 16S lab protokoller, Det skal understreges, at disse to metoder er meget forskellige i både processen og i den type data, de giver. 16S rRNA-genet er en almindeligt målrettet region, meget bevaret i bakterier og archaea, og nyttig til at karakterisere bakteriesamfundet i en prøve. Selv om en målrettet og specifik tilgang, artsniveau opløsning er ofte uopnåelig, og karakterisere nyligt divergerende arter eller stammer er vanskeligt. Contrarily, metatranscriptomics er en bredere tilgang, der fanger alle de aktive gener og mikrober til stede i en prøve. Mens 16S kun giver data til identifikation, kan metatranscriptomics give funktionelle data såsom udtrykte gener og metaboliske veje. Begge er værdifulde, og når de kombineres, kan de afsløre, hvilke bakterier der er til stede, og hvilke gener de udtrykker.
Dette papir beskriver metoder til feltindsamling og prøvebehandling for både 16S rRNA og metatranscriptomiske analyser i forbindelse med studier af fracking. Derudover beskriver den indsamlingsmetoder for DNA/RNA af høj kvalitet fra lav biomasseprøver og langtidsopbevaring. De metoder, der er beskrevet her, er kulminationen på vores erfaringer med prøveindsamling og -behandling i vores bestræbelser på at lære, hvordan fracking påvirker nærliggende vandløb ved at undersøge strukturen og funktionen af deres mikrobielle samfund. Mikrober reagerer hurtigt på forstyrrelser, og derfor, hvilke mikrober der er til stede, og de gener, de udtrykker, kan give oplysninger om virkningerne af fracking på økosystemer. Samlet set kan disse metoder være uvurderlige i vores forståelse af, hvordan fracking påvirker disse vigtige økosystemer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende finansieringskilderne til de projekter, der førte til udviklingen af disse metoder, med disse kilder er: Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) gennem Precollege og Undergraduate Science Education Program, samt af National Science Foundation (http://www.nsf.gov) gennem NSF awards DBI-1248096 og CBET-1805549.
200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |