Fecale (micro) RNA-isolatie
Summary
Dit protocol isoleert totaal RNA van hoge kwaliteit uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Een commerciële miRNA-isolatiekit wordt gebruikt met aanzienlijke aanpassing om zuiver RNA te isoleren met geoptimaliseerde kwantiteit en kwaliteit. De RNA-isolaten zijn goed voor de meeste downstream RNA-assays zoals sequencing, micro-array en RT-PCR.
Abstract
Het wordt duidelijk dat RNA voorkomt in het darmlumen en uitwerpselen bij dieren en mensen. Het hieronder beschreven protocol isoleert totaal RNA inclusief microRNA’s uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het doel is om totaal RNA met een hoge zuiverheid en hoeveelheid te isoleren voor downstream analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. De voordelen van dit geoptimaliseerde protocol in de miRNA-isolatie zijn mogelijkheden om sterk gezuiverde RNA-producten te isoleren met extra wasstappen beschreven, verhoogde hoeveelheid RNA verkregen met een verbeterde methode in de resuspensie van monster en belangrijke tips voor decontaminatie. Een beperking is het onvermogen om grotere monsters van meer dan 200 mg te verwerken en te zuiveren, omdat deze steekproefgroottes een probleem zouden veroorzaken bij de duidelijke vorming van de interfase. Bijgevolg kan de grote monstergrootte de te extraheren waterige fase zoals beschreven in het protocol verontreinigen met organische stoffen die uiteindelijk de kwaliteit van het geïsoleerde RNA beïnvloeden. RNA-isolaten uit een monster van maximaal 200 mg zijn echter voldoende voor de meeste downstream-analyses.
Introduction
Extracellulair RNA wordt erkend als een belangrijke factor die veel biologische processen bemiddelt1. Extracellulair RNA in de ontlasting werd voor het eerst gemeld in 2008 als een marker voor darmkanker en actieve colitis ulcerosa2, en het werd onlangs onthuld als een normaal onderdeel van het darmlumen en de ontlasting en bemiddelt gastheer-microbe communicatie 3,4,5. Het doel van dit RNA-isolatieprotocol is om extracellulair RNA van hoge kwaliteit te extraheren uit fecale monsters die zijn verzameld van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het protocol is aangepast van een commerciële miRNA Isolation Kit. Het verkregen RNA wordt gebruikt voor downstream-analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. Het protocol bevat verschillende belangrijke en nuttige tips om de kwantiteit en kwaliteit van RNA in de ontlasting van dieren en mensen te maximaliseren. De reden om deze methode van RNA (inclusief microRNA) isolatie te ontwikkelen en te optimaliseren, is om microbieel RNA in de ontlasting te verminderen, de variabelen in de onderzoeksstudies te beperken en de RNA-samenstelling in de darm te analyseren zonder rekening te houden met verschillende verstorende factoren en bronnen van besmetting. Van belang is dat deze RNA-isolatie de afgifte van RNA uit levende cellen en levende microben (cellulair RNA) minimaliseert. Het richt zich op extracellulaire RNA’s die zijn vrijgegeven door darmcellen of zijn verkregen via voedselinname. In principe is deze methode niet geschikt voor studies waarbij het microbiële transcriptoom wordt onderzocht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is belangrijk om RNase-vrije techniek te gebruiken om RNase-besmetting tijdens de isolatie te voorkomen7. Na centrifugatie en de vorming van een compacte interfase is het belangrijk om de interfase, de onderste fase en de deeltjesverontreiniging die op de top van de waterige fase zweven te vermijden bij het herstellen van de waterige fase. Daarnaast worden twee wasstappen met 500 μL en 250 μL Wash Solution 2/3 toegevoegd om verontreinigingen in het filtermembraan te verwijderen voor een opti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We kregen technische assistentie van de Biopolymers Facility aan de Harvard Medical School voor bioanalyzer. Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society onderzoeksbeurs RG-1707-28516 (H.L.W. en S.L.).
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
Riferimenti
- Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
- Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
- Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
- Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
- Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
- Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
- Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
- Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn’s disease biomarkers. Crohn’s & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
- Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
- Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
- Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
- Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
- Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
- Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
