Fekal (mikro) RNA-isolering
Summary
Detta protokoll isolerar högkvalitativt totalt RNA från fekala prover av djur och människor. Ett kommersiellt miRNA-isoleringssats används med betydande anpassning för att isolera rent RNA med optimerad kvantitet och kvalitet. RNA-isolaten är bra för de flesta nedströms RNA-analyser såsom sekvensering, mikromatris och RT-PCR.
Abstract
Det blir tydligt att RNA finns i tarmlumen och avföring hos djur och människor. Protokollet som beskrivs nedan isolerar totalt RNA inklusive mikroRNA från fekala prover av djur och människor. Målet är att isolera totalt RNA med hög renhet och kvantitet för nedströmsanalyser såsom RNA-sekvensering, RT-PCR och mikromatris. Fördelarna med detta optimerade protokoll i miRNA-isoleringen är förmågan att isolera högrenade RNA-produkter med ytterligare tvättsteg beskrivna, ökad mängd RNA erhållen med en förbättrad metod vid resuspension av prov och viktiga tips för dekontaminering. En begränsning är oförmågan att bearbeta och rena större prov på mer än 200 mg eftersom dessa provstorlekar skulle orsaka svårigheter vid klar bildning av interfasen. Följaktligen kan den stora provstorleken förorena den vattenfas som ska extraheras enligt beskrivningen i protokollet med organiska ämnen som påverkar kvaliteten på RNA som isoleras i slutändan. RNA-isolat från ett prov på upp till 200 mg är dock tillräckliga för de flesta nedströmsanalyser.
Introduction
Extracellulärt RNA blir erkänt som en viktig faktor som förmedlar många biologiska processer1. Extracellulärt RNA i avföring rapporterades först 2008 som en markör för tjocktarmscancer och aktiv ulcerös kolit2, och det avslöjades nyligen som en normal komponent i tarmlumen och avföring och förmedlar värd-mikrobkommunikation 3,4,5. Syftet med detta RNA-isoleringsprotokoll är att extrahera extracellulärt RNA av hög kvalitet från fekala prover som samlats in från djur och människor. Protokollet anpassades från ett kommersiellt miRNA Isolation Kit. Det förvärvade RNA används för nedströmsanalyser såsom RNA-sekvensering, RT-PCR och mikromatris. Protokollet innehåller flera viktiga och användbara tips för att maximera kvantiteten och kvaliteten på RNA som finns i avföring från djur och människor. Anledningen till att utveckla och optimera denna metod för RNA -isolering (inklusive mikroRNA) är att minska mikrobiellt RNA i avföringen, begränsa variablerna i forskningsstudierna och analysera RNA -kompositionen i tarmen utan att redovisa olika förvirrande faktorer och föroreningskällor. Observera att denna RNA-isolering minimerar frisättningen av RNA från levande celler och levande mikrober (cellulärt RNA). Det fokuserar på extracellulära RNA som har släppts av tarmceller eller förvärvats via matintag. I huvudsak är denna metod inte lämplig för studier där det mikrobiella transkriptomet undersöks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är viktigt att använda RNas-fri teknik för att förhindra RNas-kontaminering under isoleringen7. Efter centrifugering och bildandet av en kompakt interfas är det viktigt att undvika interfas, lägre fas och partikelföroreningen som flyter på toppen av vattenfasen när man återvinner vattenfasen. Dessutom tillsätts två tvättsteg med 500 μL och 250 μL Tvättlösning 2/3 för att eliminera föroreningar i filtermembranet för optimerad kvalitet. Dessutom rekommenderas inte ett startpr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi fick teknisk hjälp från Biopolymers Facility vid Harvard Medical School för bioanalysator. Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society forskningsanslag RG-1707-28516 (H.L.W. och S.L.).
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
Riferimenti
- Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
- Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
- Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
- Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
- Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
- Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
- Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
- Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn’s disease biomarkers. Crohn’s & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
- Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
- Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
- Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
- Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
- Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
- Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
