وقد تورطت مناطق المخيخ المختلفة للعب دور في النواتج السلوكية المتميزة، ومع ذلك لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة. يصف هذا العمل طريقة لتشريح قشرة المخيخ بشكل مستنسخ وسريع في نصفي الكرة الأرضية والمناطق الأمامية والخلفية من الحشرات ، والنوى المخيخية العميقة من أجل التحقيق في الاختلافات الجزيئية عن طريق عزل الحمض النووي الريبي واختبار الاختلافات في التعبير الجيني.
المخيخ يلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الرئيسية بما في ذلك السيطرة على الحركة, توازن, الإدراك, مكافأة, وتؤثر. تشير دراسات التصوير إلى أن مناطق المخيخ المتميزة تساهم في هذه الوظائف المختلفة. الدراسات الجزيئية دراسة الاختلافات المخيخ الإقليمية متخلفة كما يتم في الغالب على مقتطفات المخيخ كله وبالتالي إخفاء أي تمييز عبر مناطق المخيخ محددة. هنا نصف تقنية لتشريح أربع مناطق مخيخية مختلفة بشكل مستنسخ وسريع: نواة المخيخ العميقة (DCN) ، قشرة المخيخ الأمامية والخلفية ، والقشرة المخيخية في نصفي الكرة الأرضية. تشريح هذه المناطق المتميزة يسمح باستكشاف الآليات الجزيئية التي قد تكمن وراء مساهماتها الفريدة في التوازن والحركة والتأثير والإدراك. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لاستكشاف الاختلافات في قابلية المرضية من هذه المناطق المحددة عبر نماذج مختلفة مرض الماوس.
المخيخ يحتوي على أكثر من نصف الخلايا العصبية في الدماغ، وقد تاريخيا يشار إليها باسم مركز التحكم في المحركات والتوازن في الدماغ1. في الآونة الأخيرة ، أثبتت الدراسات أن المخيخ يلعب دورا رئيسيا في وظائف أخرى مختلفة بما في ذلك الإدراك ، ومعالجة المكافأة ، وتؤثر على2و3و4و5.
المخيخ لديه تشريح موصوف جيدا: تتكون منطقة القشرة من حبيبات وبوركينجي وطبقات جزيئية. تشكل خلايا الحبيبات طبقة الخلية الحبيبية وترسل مدخلات عبر ألياف متوازية إلى تشعبات خلايا بوركينجي للطبقة الجزيئية التي تتلقى أيضا مدخلات من ألياف التسلق التي نشأت في الزيتون السفلي. ترسل خلايا بوركينجي إسقاطات مثبطة إلى الخلايا في نواة المخيخ العميقة (DCN) ، والتي تعمل كخرج رئيسي من المخيخ. يتم تعديل إخراج هذه الدائرة المخيخية من خلال نشاط الخلايا الداخلية المثبطة في قشرة المخيخ ، بما في ذلك Golgi و stellate و خلايا السلة4. يتم توزيع هذه الوحدة الوظيفية المخيخ في جميع أنحاء lobules من قشرة المخيخ. على الرغم من هذه الدوائر موحدة نسبيا عبر المخيخ, الأدلة من الأدب التصوير العصبي البشري ودراسات المريض يشير إلى عدم التجانس الوظيفي للميخيخ6,7.
يمكن تقسيم قشرة المخيخ إلى منطقتين رئيسيتين: الحشرات المحددة في منتصف الخط، ونصفي الكرة الأرضية الجانبيين. يمكن تقسيم الحشرات إلى مصابيح الأمامي والخلفي. وقد تورطت هذه المناطق المتميزة من المخيخ في المساهمة في سلوكيات مختلفة. أنماط النشاط التي تثيرها المهام أو الخالية من المهام تورط فيها أن المناطق الأمامية من الحشرات تساهم بشكل أكبر في الوظيفة الحركية في حين تساهم الحشرات الخلفية بشكل أكبر في الإدراك6 ،7. ويرتبط أيضا مع vermis تؤثر والعواطف، في حين أن نصفي المخيخ تسهم في التنفيذية والبصرية المكانية واللغة، وغيرها من الوظائف الذاكرية8. بالإضافة إلى ذلك، قدمت الدراسات التشريحية أدلة على أن مناطق المخيخ المتميزة وظيفيا ترتبط بالمناطق القشرية المختلفة9. كشف رسم خرائط أعراض الآفة أن المرضى الذين يعانون من السكتات الدماغية التي تؤثر على الفص الأمامي (تمتد إلى lobule VI) كان أداؤهم ضعيفا في المهام الحركية الدقيقة ، في حين أظهر المرضى الذين يعانون من تلف في مناطق الفص الخلفي ونصفي الكرة الأرضية عجزا معرفيا في غياب متلازمة المخيخ الحركي10. وأخيرا ، تشير أمراض المخيخ الإقليمية في المرض إلى أن مناطق المخيخ المتميزة وظيفيا معرضة أيضا بشكل مختلف للمرض11و12.
في حين أن أقل بكثير استكشافها، والأدلة الأولية يدل على توقيعات التعبير الجيني متميزة عبر المناطق القشرية المخيخية. Purkinje تعبير الخلية من زيبرين الثاني يظهر نمط المنطقة محددة في vermis بحيث يكون هناك المزيد من الخلايا الإيجابية زيبريني الثاني في lobules الخلفي وأقل في lobulesالأمامية 13. ويرتبط هذا أيضا مع وظيفة الفسيولوجية متميزة إقليميا كما Zebrin II خلايا بوركينجي السلبية عرض وتيرة أعلى من إطلاق منشط من خلايا بوركينجي التي هي زيبرين الثانيإيجابية 14.
بالإضافة إلى قشرة المخيخ ، يتضمن المخيخ نواة المخيخ العميقة (DCN) التي تعمل كخرج أساسي للميخيخ. تتكون النوى من الوسيط (MN) ، المتشابكة (IN) ، والنوى الجانبية (LN). وقد أظهرت دراسات التصوير الوظيفي والمريض أن DCN تشارك أيضا في السلوكيات المختلفة15، ولكن دراسات قليلة جدا دراسة تغيير التعبير الجيني في DCN.
جعلت التقدم في التقنيات الجزيئية من الممكن تقييم التعبير الجيني الإقليمي في الدماغ وكشفت عن عدم التجانس عبر وداخل مناطق الدماغ المختلفة في كل من الحالات الفسيولوجيةوالمرضية 16. مثل هذه الدراسات تورط أن المخيخ يختلف عن مناطق الدماغ الأخرى. على سبيل المثال، يتم عكس نسبة الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في المخيخ مقارنة مع مناطق الدماغ الأخرى1. حتى في الظروف الفسيولوجية العادية ، يتم تنظيم التعبير عن الجينات proinflammatory في المخيخ مقارنة بالمناطق الدماغية الأخرى17. كما كانت التقنيات الجزيئية مفيدة للغاية في تحديد المسارات التي تساهم في مسببات أمراض المخيخ. على سبيل المثال، حدد تسلسل الحمض النووي الريبي لمستخلصات المخيخ بأكملها الجينات التي تم تغييرها في نموذج فأرة معدل وراثيا محدد لخلية بوركينجي من نوع ترنح سبينوكيربيلار 1 (SCA1) بالمقارنة مع ضوابط النوع البرية الخاصة بهم. وقد كشفت هذه الأدلة المسارات الجزيئية الرئيسية الكامنة وراء الإمراض في خلايا المخيخ بوركينجي وساعد على تحديد الأهداف العلاجية المحتملة18. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن هناك اختلافات في التعرض للأمراض عبر مناطق المخيخ11و12و19. وهذا يمكن أن يشير إلى أن هناك تغييرات رئيسية تحدث في مناطق المخيخ متميزة، والتي قد تكون ملثمين أو غير مكتشفة مع مقتطفات المخيخ كله. وبالتالي، هناك حاجة لتطوير التقنيات التي تسمح للباحثين بفحص الملامح الجزيئية في مناطق المخيخ المختلفة.
وتصف التقنية المقترحة هنا طريقة قابلة للاستنساخ لتشريح أربع مناطق متميزة من المخيخ الماوس من أجل عزل الحمض النووي الريبي من تلك المناطق واستكشاف الاختلافات الإقليمية في التعبير الجيني. التخطيطي للميخيخ الماوس في الشكل 1A يسلط الضوء على vermis باللون الأزرق، ونصف الكرة الأرضية باللون الأصفر. على وجه التحديد، هذه التقنية تجعل من الممكن عزل أربع مناطق: نواة المخيخ العميق (DCN) (مربعات حمراء منقط في الشكل 1A)،القشرة المخيخية من الحشرات الأمامية (CCaV) (الأزرق الداكن في الشكل 1A)، القشرة المخيخية للفيرميس الخلفي (CCpV) (الأزرق الفاتح في الشكل 1A)،والقشرة المخيخية لنصفي الكرة الأرضية (CCH) (الأصفر في الشكل 1A). ومن خلال تقييم التعبير الجيني لهذه المناطق بشكل منفصل، سيكون من الممكن التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظائف منفصلة لهذه المناطق المختلفة، فضلا عن الاختلافات المحتملة في ضعفها في المرض.
الطريقة الموصوفة هنا تجعل من الممكن تقييم التعبير الجيني الأساسي والآليات الجزيئية داخل أربع مناطق مخيخ متميزة – النوى المخيخية العميقة (DCN) ، والقشرة المخيخية الأمامية للفيرميس (CCaV) ، والقشرة المخيخية الخلفية للفيرميس (CCpV) ، والقشرة المخيخية لنصفي الكرة الأرضية (CCH). إن القدرة على تقييم هذ?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لأوستن فيرو وجواو غيليرمي روزا في مختبر سفيتانوفيتش لمساعدتهم في استكشاف الأخطاء وإصلاحها تشريح وفي استخراج الجيش الملكي النيبالي وRTqPCR. يتم تمويل هذا البحث من قبل M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS المعاهد الوطنية للصحة (NIH).
1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
Blunt forceps | |||
Chloroform | Macron | 220905 | |
Decapitation Scissors | |||
Dissecting Scissors | |||
Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
Ice Bucket | |||
Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
Micro Spatula | |||
Needle Nose forceps | |||
Petri Dish | Pyrex | ||
Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
Vascular Scissors |