분자 분석을 위한 소뇌 지역 해부
Summary
다른 소뇌 영역은 뚜렷한 행동 출력에 있는 역할을 하기 위하여 연루되었습니다, 그러나 근본적인 분자 기계장치는 알려지지 않은 남아 있습니다. 이 작품은 RNA를 분리하고 유전자 발현의 차이를 테스트하여 분자 차이를 조사하기 위해 반구, 전방 및 후방 영역 및 깊은 소뇌 핵의 소뇌 피질을 재현하고 신속하게 해부하는 방법을 설명합니다.
Abstract
소뇌는 운동, 균형, 인식, 보상 및 영향을 제어하는 등 여러 가지 주요 기능에서 중요한 역할을합니다. 이미징 연구는 뚜렷한 소뇌 부위가 이러한 다른 기능에 기여한다는 것을 나타냅니다. 지역 소뇌 차이를 검사하는 분자 연구는 주로 전체 소뇌 추출물에서 수행되어 특정 소뇌 부위에 걸쳐 구별을 마스킹하기 때문에 뒤쳐지고 있습니다. 여기에서 우리는 4개의 다른 소뇌 지역: 깊은 소뇌 핵 (DCN), 전방 및 후방 버피소 피질, 그리고 반구의 소뇌 피질의 4개의 다른 소뇌 지구를 재보적으로 그리고 빨리 해부하는 기술을 기술합니다. 이러한 뚜렷한 영역을 해부하면 균형, 운동, 영향 및 인식에 대한 독특한 기여의 기초가 될 수 있는 분자 메커니즘의 탐사를 허용합니다. 이 기술은 또한 각종 마우스 질병 모형을 통해 이 특정 지역의 병리학 감수성에 있는 다름을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
소뇌는 뇌의 뉴런의 절반 이상을 포함하고 역사적으로 뇌1의모터 제어 및 균형 센터로 언급되었습니다. 최근에는 소뇌가 인지, 보상 처리,2,3,4,5에영향을 미치는 등 다양한 기능에서 핵심적인 역할을 한다는 것을입증했습니다.
소뇌는 잘 설명 된 해부학을 가지고 : 피질 영역은 과립, Purkinje, 및 분자 층으로 구성되어 있습니다. 과립 세포는 과립 세포 층을 형성하고 열등한 올리브에서 유래한 등반 섬유로부터 입력을 받는 분자 층의 Purkinje 세포 모순자로 병렬 섬유를 통해 입력을 보냅니다. Purkinje 세포는 소뇌에서 주요 출력역할을 깊은 소뇌 핵 (DCN)에서 세포에 억제 프로젝션을 보냅니다. 이러한 소뇌 회로의 출력은 골기, 스텔레이트 및 바구니세포(4)를포함하는 소뇌 피질내의 억제 중뉴런의 활성에 의해 더 변조된다. 이 소뇌 기능 단위는 소뇌 피질의 모든 소구에 걸쳐 분포된다. 소뇌에 걸쳐이 상대적으로 균일 한 회로에도 불구하고, 인간의 신경 이미징 문헌 및 환자 연구에서 증거는소뇌의기능이질성을 나타냅니다6,7.
소뇌 피질은 두 가지 주요 영역으로 나눌 수 있습니다: 중간선 정의 된 vermis, 및 측면 반구. vermis는 전방 및 후방 소구로 더 나눌 수 있습니다. 소뇌의 이 명백한 지구는 다른 행동에 기여에 연루되었습니다. 태스크 호출 또는 작업 없는 활동 패턴은 vermis의 전방 영역이 모터 기능에 더 많이 기여하는 반면 후방 vermis는 인식6,7에더 많은 기여를 한다는 것을 암시합니다. vermis는 또한 영향과 감정과 연결되어 있으며, 소뇌 반구는 집행, 시각 공간, 언어 및 기타 mnemonic 함수8에기여합니다. 또한, 해부학 연구는 기능적으로 뚜렷한 소뇌 영역이 다른 피질영역9과연결되어 있다는 증거를 제공했다. 병변 증상 매핑은 전방 비골 (소두 VI로 확장)에 영향을 미치는 뇌졸중환자가 미세 운동 작업에 대한 성능이 좋지 않은 반면, 후방 엽 영역 및 반구에 손상을 입은 환자는 소뇌 운동 증후군10의부재시 인지 적자를 나타냈다는 것을 밝혔다. 마지막으로, 질병의 지역 소뇌 병리학은 기능적으로 뚜렷한 소뇌 부위가질병(11,12)에다르게 취약하다는 것을 나타낸다.
훨씬 덜 탐구하는 동안, 예비 기록은 소뇌 피질 지구에 걸쳐 명백한 유전자 발현 서명을 보여줍니다. 제브린 II의 Purkinje 세포 발현은 후방 로두에 더 많은 제브린 II 양성 세포가 있고 전방외구(13)에서더 적은 수 있도록 vermis에서 영역 특정 패터닝을 나타낸다. 이것은 또한 Zebrin II 음성 Purkinje 세포가 Zebrin II 양성14인Purkinje 세포 보다는 강장성 발사의 더 높은 주파수를 표시하기 때문에 지역적으로 명백한 생리기능과 상관관계가 있습니다.
소뇌 피질 이외에, 소뇌는 소뇌에 대한 1 차적인 출력으로 봉사하는 깊은 소뇌 핵 (DCN)을 포함합니다. 핵은 내측 (MN), 중측 (IN), 및 측면 핵 (LN)으로 구성됩니다. 기능성 이미징 및 환자 연구는 DCN이 또한 다양한 행동에 참여하는 것으로 나타났습니다15,그러나 DCN에 있는 유전자 발현 변경을 검토하는 거의 연구 결과.
분자 기술의 어드밴스는 뇌의 지역 유전자 발현을 평가할 수 있게 되었으며 생리학적 및 질병상태(16)의다른 뇌 영역 을 가로질러 다른 뇌 영역 내에서 이질성을 발견했습니다. 이러한 연구는 소뇌가 다른 뇌 영역과 다르다는 것을 연루시합니다. 예를 들어, 신경교 세포에 대한 뉴런의 비율은 다른 뇌 영역1에비해 소뇌에서 반전된다. 정상적인 생리학적 조건에서도, 선동적인 유전자의 발현은 다른 뇌영역(17)에비해 소뇌에서 강화된다. 분자 기술은 또한 소뇌 질환의 발병에 기여하는 경로를 식별하는 데 매우 유용했습니다. 예를 들어, 전체 소뇌 추출물의 RNA 염기서열분석기는 야생형 대조군과 비교하여 퍼킨제 세포 특이적 형형 마우스 모델인 척추유발실래1(SCA1)에서 변경된 유전자를 확인하였다. 이러한 증거는 소뇌 Purkinje 세포에 있는 기체 발생의 근본적인 중요한 분자 통로를 제시하고 잠재적인 치료 표적18을확인하는 것을 도왔습니다. 그러나, 최근 연구는 소뇌 지역(11,12,19)에걸쳐 질병에 대한취약성에차이가 있음을 시사한다. 이것은 전체 소뇌 추출물로 가려지거나 발견되지 않을 수 있는 뚜렷한 소뇌 지역에서 일어나는 중요한 변경이 있다는 것을 나타낼 수 있었습니다. 따라서, 연구원이 다른 소뇌 지구에 있는 분자 단면도를 검토하는 것을 허용하는 기술을 개발할 필요가 있습니다.
여기에서 제안된 기술은 그 지구에서 RNA를 격리하고 유전자 발현에 있는 지역적 다름을 탐구하기 위하여 마우스 소뇌의 4개의 별개의 지구를 해부하는 재현가능한 방법을 기술합니다. 도 1A에서 마우스 소뇌의 회로도는 파란색의 vermis와 노란색의 반구를 강조합니다. 구체적으로, 이 기술은 4개의 영역을 격리할 수 있게 합니다: 깊은 소뇌 핵 (DCN) (도 1A에있는 빨간 점선 상자), 전방 버미스 (CCaV)의 소뇌 피질 (CCaV) (다크 블루) 도 1A에서),후방 버미스(CCpV)의 소뇌 피질(도 1A에서연한 파란색), 반구(CCH)의 소뇌 피질(도 1A에서노란색). 이 지구의 유전자 발현을 별도로 평가함으로써, 이 다른 지구의 이산 기능의 근본적인 분자 기계장치뿐만 아니라 질병에 있는 그들의 취약성에 있는 잠재적인 다름을 조사할 수 있을 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명된 방법은 4개의 명백한 소뇌 지역 내의 근본적인 유전자 발현 및 분자 기계장치를 평가할 수 있게 합니다 – 깊은 소뇌 핵 (DCN), vermis의 전방 소뇌 피질 (CCaV), vermis의 후방 소뇌 피질 (CCpV), 및 반구의 소뇌 피질 (CCH). 이 지역을 별도로 평가하는 능력은 특정 소뇌 지역의 이질성에 대한 우리의 지식을 확장하고 다양한 행동에 대한 기여도를 밝힐 것입니다.
전체 뇌 조?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 해부 와 RNA 추출 및 RTqPCR에서 문제 해결에 그들의 도움에 대한 Cvetanovic 실험실에서 오스틴 페로와 Juao-Guilherme 로사에 감사드립니다. 이 연구는 M. Cvetanovic에 의해 투자, R01 NS197387; HHS | 건강의 국가 학회 (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
Riferimenti
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