アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法
Summary
アフリカツメガエル卵からの希釈されていない細胞質抽出物の調製およびライブイメージングの方法を記載する。
Abstract
伝統的にバルク生化学的アッセイに使用されてきた アフリカツメガエル 卵抽出物は、細胞質分裂、有糸分裂紡錘体形成、核の組み立てなどの細胞質現象を研究するための強力なイメージングベースのツールとして登場しています。まばらな時点でサンプリングされた固定抽出物を画像化する初期の方法に基づいて構築され、最近のアプローチは、タイムラプス顕微鏡を使用してライブ抽出を画像化し、時間分解能を高めてより動的な特徴を明らかにします。これらの方法は、通常、イメージング容器の高度な表面処理を必要とする。ここでは、化学的表面処理を必要としない卵抽出物のライブイメージングの代替方法を紹介します。実装が簡単で、大量生産された実験用消耗品をイメージングに利用します。広視野顕微鏡と共焦点顕微鏡の両方に使用できるシステムについて説明します。2次元(2D)フィールドでの抽出物のイメージング用に設計されていますが、3Dでのイメージングに簡単に拡張できます。細胞質内の空間パターン形成の研究に適しています。代表的なデータを使用して、この方法を使用して調製された間期抽出物における微小管、核、ミトコンドリアの典型的な動的組織を示します。これらの画像データは、細胞質動態や空間構成に関する定量的な情報を提供することができます。
Introduction
細胞質は細胞の主要な体積を構成し、明確な組織を持っています。真核生物の細胞質の成分は、微小管アスターやゴルジ体装置などの幅広い空間構造に自己組織化することができ、細胞の同一性や生理状態に応じて動的に配置され、ひっくり返されます。したがって、細胞質の空間構成と細胞機能へのリンクを理解することは、細胞がどのように機能するかを理解するために重要です。アフリカツメガエル卵抽出物は、伝統的にバルク生化学的アッセイに使用されてきました1,2,3,4,5,6,7,8、しかし最近の研究は、細胞質構造とその細胞機能の機構研究のための強力なライブイメージングシステムとして確立されています9,10,11、 12,13,14,15,16,17,18。これらの希釈されていない抽出物は、細胞質の多くの構造と機能を保存する一方で、従来の細胞ベースのモデルでは達成できなかった細胞質内容物の直接操作を可能にします19,20。これにより、細胞質現象を特徴付け、その機構的基盤を解剖するのに理想的です。
抽出物をイメージングするための既存の方法は、化学的表面修飾、またはマイクロ流体デバイスの製造を必要とします。カバーガラスベースの方法の1つは、ガラスカバーガラス21のポリエチレングリコール(PEG)パッシベーションを必要とする。マイクロエマルジョンベースの方法では、ガラス表面22,23へのトリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランの蒸着が必要です。マイクロ流体ベースのシステムは、抽出液滴の量、形状および組成の正確な制御を可能にするが、特殊な微細加工設備を必要とする11、12、24。
ここでは、実施が容易で、容易に入手可能で低コストの材料を利用する卵抽出物のイメージングの代替方法を紹介します。これには、スライドとフッ素化エチレンプロピレン(FEP)テープでコーティングされたカバーガラスを備えたイメージングチャンバーの準備が含まれます。このチャンバーは、ステレオスコープや正立顕微鏡、倒立顕微鏡など、さまざまな顕微鏡システムで抽出物をイメージングするために使用できます。この方法は、表面の化学的処理を必要とせず、上記の既存のガラスベースの方法で得られるのと同様の光学的透明度を達成します。これは、2Dフィールド全体で均一な厚さの抽出物の層を画像化するように設計されており、3Dボリュームの抽出物を画像化するために簡単に拡張できます。広い視野にわたる集団細胞質挙動のタイムラプスイメージングに適しています。
我々は、イメージング方法を実証するために、間期停止卵抽出物を使用しました。抽出物の調製は、デミングおよびコーンブルース19のプロトコルに従います。簡単に言えば、減数分裂IIの中期に自然に停止した卵は、低速スピンによって押しつぶされます。このスピンは細胞質を減数分裂停止から解放し、抽出物が間期に進むことを可能にします。通常、サイトカラシンBは、F-アクチン形成を阻害するために、破砕スピンの前に添加される。但し、F-アクチンを希望する場合は省略することができる。シクロヘキシミドは、間期抽出物が次の有糸分裂に入るのを防ぐために、粉砕スピンの前にも添加されます。続いて、抽出物を前述のイメージングチャンバーに入れ、顕微鏡上に配置します。最後に、顕微鏡に接続されたカメラによって定義された間隔で画像が経時的に記録され、2Dフィールドでの抽出物の動的挙動をキャプチャするタイムラプス画像シリーズが生成されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
アフリカツメガエル卵抽出物は、さまざまな細胞内構造10、14、15、16、17、18、21、31、32、33、34、35、<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿へのコメントをくださったJ. Kamenz、Y. Chen、W. Y. C. Huangに感謝します。この研究は、ジェームズE.フェレルジュニアに授与された国立衛生研究所(R01 GM110564、P50 GM107615、およびR35 GM131792)からの助成金によってサポートされました。
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
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