Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica
Summary
Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .
Abstract
Tradicionalmente utilizados para ensayos bioquímicos a granel, los extractos de huevo de Xenopus laevis se han convertido en una poderosa herramienta basada en imágenes para estudiar fenómenos citoplasmáticos, como la citocinesis, la formación del huso mitótico y el ensamblaje del núcleo. Basándose en los primeros métodos que tomaban imágenes de extractos fijos muestreados en puntos de tiempo dispersos, los enfoques recientes de imágenes de extractos en vivo utilizando microscopía de lapso de tiempo, revelando características más dinámicas con una resolución temporal mejorada. Estos métodos generalmente requieren tratamientos superficiales sofisticados del vaso de imágenes. Aquí presentamos un método alternativo para obtener imágenes en vivo de extractos de huevo que no requieren tratamiento químico de superficie. Es fácil de implementar y utiliza consumibles de laboratorio producidos en masa para obtener imágenes. Describimos un sistema que se puede utilizar tanto para microscopía de campo amplio como para microscopía confocal. Está diseñado para extractos de imágenes en un campo de 2 dimensiones (2D), pero se puede extender fácilmente a imágenes en 3D. Es muy adecuado para estudiar la formación de patrones espaciales dentro del citoplasma. Con datos representativos, demostramos la organización dinámica típica de microtúbulos, núcleos y mitocondrias en extractos de interfase preparados utilizando este método. Estos datos de imagen pueden proporcionar información cuantitativa sobre la dinámica citoplasmática y la organización espacial.
Introduction
El citoplasma constituye el volumen principal de una célula y tiene una organización distinta. Los ingredientes del citoplasma eucariota pueden autoensamblarse en una amplia gama de estructuras espaciales, como los ásteres de microtúbulos y el aparato de Golgi, que a su vez están dispuestos dinámicamente y se voltean dependiendo de la identidad y el estado fisiológico de la célula. Por lo tanto, comprender la organización espacial del citoplasma y su vínculo con las funciones celulares es importante para comprender cómo funciona la célula. Los extractos de huevo de Xenopus laevis se han utilizado tradicionalmente para ensayos bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8, pero trabajos recientes los establecen como un poderoso sistema de imágenes en vivo para estudios mecanicistas de estructuras citoplasmáticas y sus funciones celulares 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Estos extractos no diluidos preservan muchas estructuras y funciones del citoplasma, al tiempo que permiten manipulaciones directas de los contenidos citoplasmáticos no alcanzables en modelos convencionales basados en células19,20. Esto los hace ideales para caracterizar fenómenos citoplasmáticos y diseccionar sus fundamentos mecanicistas.
Los métodos existentes para obtener imágenes de extractos requieren modificaciones químicas de la superficie o la fabricación de dispositivos microfluídicos. Un método basado en cubreobjetos requiere la pasivación del polietilenglicol (PEG) de los cubreobjetos de vidrio21. Un método basado en microemulsiones requiere la deposición de vapor de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano en superficies de vidrio22,23. Los sistemas basados en microfluídicos permiten un control preciso del volumen, geometría y composición de las gotas de extracción, pero requieren instalaciones especializadas de microfabricación11,12,24.
Aquí presentamos un método alternativo para obtener imágenes de extractos de huevo que es fácil de implementar y utiliza materiales fácilmente disponibles y de bajo costo. Esto incluye la preparación de una cámara de imágenes con un portaobjetos y un cubreobjetos recubiertos con cinta de etileno propileno fluorado (FEP). La cámara se puede utilizar para extraer imágenes con una variedad de sistemas de microscopía, incluidos estereoscopios y microscopios verticales e invertidos. Este método no requiere tratamiento químico de superficies, al tiempo que logra una claridad óptica similar obtenida con los métodos existentes basados en vidrio discutidos anteriormente. Está diseñado para obtener imágenes de una capa de extractos con un grosor uniforme en un campo 2D, y se puede extender fácilmente para obtener imágenes de un volumen 3D de extractos. Es muy adecuado para imágenes de lapso de tiempo del comportamiento citoplasmático colectivo en un amplio campo de visión.
Hemos utilizado extractos de huevo detenidos entre fases para demostrar nuestro método de imagen. La preparación del extracto sigue el protocolo de Deming y Kornbluth19. Brevemente, los huevos naturalmente detenidos en la metafase de la meiosis II son aplastados por un giro de baja velocidad. Este giro libera el citoplasma del paro meiótico y permite que el extracto proceda a la interfase. Normalmente, la citocalasina B se agrega antes del giro de trituración para inhibir la formación de actina F. Sin embargo, se puede omitir si se desea F-actina. La cicloheximida también se agrega antes del centrifugado para evitar que el extracto de interfase entre en la siguiente mitosis. Los extractos se colocan posteriormente en las cámaras de imagen antes mencionadas y se colocan en un microscopio. Finalmente, las imágenes se registran a lo largo del tiempo a intervalos definidos por una cámara conectada al microscopio, produciendo series de imágenes de lapso de tiempo que capturan el comportamiento dinámico del extracto en un campo 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los extractos de huevos de Xenopus laevis se han convertido en un poderoso sistema modelo para estudios basados en imágenes de diversas estructuras subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 y organización citoplasmática en su conjunto<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a J. Kamenz, Y. Chen y W. Y. C. Huang por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM110564, P50 GM107615 y R35 GM131792) otorgadas a James E. Ferrell, Jr.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
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