Detta dokument presenterar en strategi för att bygga finita elementmodeller av fibrösa ledande material som utsätts för ett elektriskt fält (EF). Modellerna kan användas för att uppskatta den elektriska inmatning som celler som sås i sådana material får och bedöma effekten av att ändra byggnadsställningens ingående materialegenskaper, struktur eller orientering.
Kliniska studier visar elektrisk stimulering (ES) vara en potentiell terapi för läkning och regenerering av olika vävnader. Att förstå mekanismerna för cellrespons när de utsätts för elektriska fält kan därför vägleda optimeringen av kliniska applikationer. In vitro-experiment syftar till att hjälpa till att avslöja dem, vilket ger fördelen med bredare insats- och utdataintervall som kan bedömas etiskt och effektivt. Framstegen i in vitro-experiment är dock svåra att reproducera direkt i kliniska miljöer. Främst beror det på att de ES-enheter som används in vitro skiljer sig avsevärt från de som är lämpliga för patientanvändning, och vägen från elektroderna till de riktade cellerna är annorlunda. Att översätta in vitro-resultaten till in vivo-förfaranden är därför inte okomplicerat. Vi betonar att cellulära mikromiljöns struktur och fysiska egenskaper spelar en avgörande roll i de faktiska experimentella testförhållandena och föreslår att mått på laddningsfördelning kan användas för att överbrygga klyftan mellan in vitro och in vivo. Med tanke på detta visar vi hur i silico finita element modellering (FEM) kan användas för att beskriva cellulära mikromiljö och de förändringar som genereras av elektrisk fält (EF) exponering. Vi lyfter fram hur EF parar sig med geometrisk struktur för att bestämma laddningsfördelningen. Vi visar sedan effekten av tidsberoende ingångar på laddningsrörelser. Slutligen visar vi relevansen av vår nya metodik i silico modell med hjälp av två fallstudier: (i) in vitro fibrös Poly (3,4-etylendioxythiophene) poly (styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) byggnadsställningar och (ii) in vivo kollagen i extracellulär matris (ECM).
ES är användningen av EU-fonder i syfte att kontrollera biologiska celler och vävnader. Dess mekanism är baserad på den fysiska stimulansen som transducerats till cellen när biomolekylerna inuti och runt den utsätts för en externt genererad spänningsgradient. Laddade partiklar är engagerade i en organiserad rörelse som styrs av Coulombs lag, vilket genererar dragkrafter på de outforskade partiklarna. Det resulterande vätskeflödet och laddningsfördelningen förändrar cellaktiviteter och funktioner som vidhäftning, sammandragning, migration, orientering, differentiering och spridning1 när cellen försöker anpassa sig till förändringen i mikromiljön.
Eftersom EU-fonder är kontrollerbara, icke-invasiva, icke-farmakologiska och har visat sig ha en effektiv inverkan på väsentligt cellbeteende är ES ett värdefullt verktyg för vävnadsteknik och regenerativ medicin. Det har framgångsrikt använts för att vägledaneurala 2,skelett3,hjärtmuskel4,ben5 och hud6 utveckling. Dessutom, eftersom det förbättrar jontofores7, används det som ett alternativ eller kompletterande behandling till konventionella farmakologiska. Dess effektivitet i smärtlindring diskuteras fortfarande som högre kvalitet kliniska prövningar väntar8,9,10. Ändå rapporterades inga negativa effekter och det har potential att förbättra patientens välfärd11,12,13,14,15.
Medan endast kliniska prövningar kan ge en slutgiltig bedömning för effekten av ett förfarande, är in vitro och i silico-modeller skyldiga att informera utformningen av förutsägbar ES-behandling eftersom de erbjuder starkare kontroll över ett bredare spektrum av experimentella tillstånd. Den undersökta kliniska användningen av ES är benregenerering16,17,återhämtning av denervated muskler18,19,axonal regenerering efter kirurgi20,21, smärtlindring22,sårläkning 23,24,25 och jontoforesisk läkemedelsleverans26. För att ES-produkter ska kunna introduceras i stor utsträckning på alla möjliga målansökningar har kliniska prövningar ännu inte fastställt starkare bevis för effektiv behandling. Även på områden där både in vivo-djur- och människostudier konsekvent rapporterar positiva resultat, avskräcker det stora antalet rapporterade metoder i kombination med för lite vägledning om hur man väljer mellan dem och högt förvärvspris kliniker från att investera i ES-enheter27. För att komma till rätta med detta kan målvävnaden inte längre behandlas som en svart låda (gräns för in vivo-experiment) utan måste ses som en komplex synergi mellan flera delsystem (figur 1).
Flera ES-experiment har utförts in vitro under åren28,29,30,31,32,33,34. De flesta av dessa karakteriserar endast ES genom spänningsfallet mellan elektroderna dividerat med avståndet mellan dem – en grov approximation av den elektriska fältstorleken. Men själva elfältet påverkar bara laddade partiklar, inte celler direkt. När flera material är inbördes mellan enheten och cellerna kanske den grova approximationen inte håller.
En bättre karakterisering av ingångssignalen kräver en tydlig bild av hur stimulansen omvandlas till cellen. Huvudmetoderna för att leverera ES är direkt, kapacitiv och induktiv koppling35,36. Anordningar för varje metod skiljer sig åt med elektrodtyp (stång, planar eller lindning) och placering i förhållande till målvävnaden (i kontakt eller isolerad)35. Enheter som används in vivo för längre behandlingar måste vara bärbara, så elektroderna och de flesta gånger är energikällan antingen implanterad eller fäst vid huden som sårförband eller elektroaktiva fläckar. Den genererade spänningsgradienten förskjuter laddade partiklar i behandlingsområdet.
Eftersom det påverkar det resulterande laddade partikelflödet i närheten av cellerna är ställningsstrukturen av yttersta vikt vid utformningen av ES-protokoll. Olika laddningstransportkonfigurationer uppstår om plattformsmaterialet, syntestekniken, strukturen eller orienteringen i förhållande till spänningsgradienten ändras. In vivo påverkas tillgången till och rörelsen av laddade partiklar inte bara av celler utan också av kollagennätet och interstitiell vätska som komponerar den stödjande ECM. Konstruerade byggnadsställningar används alltmer för att bättre återskapa naturliga cellmikromiljöerna in vitro1,35. Samtidigt är ECM en komplex naturlig byggnadsställning.
Konstgjorda byggnadsställningar är baserade på metaller, ledande polymerer och kol, konstruerade med fokus på att balansera biokompatibilitet med elektrokemisk prestanda och långsiktig stabilitet36. En mångsidig byggnadsställningstyp är den elektrospunfibrösa mattan som erbjuder en kontrollerbar topografi i nanoskala. Detta kan konstrueras för att likna ECM, vilket ger liknande mekaniska signaler som hjälper regenerering av ett brett spektrum avvävnader 37. För att väsentligt påverka ES måste mattorna i viss mån vara ledande. Ledande polymerer är dock svåra att elektrospin och blandning med isolerande bärare begränsar konduktiviteten hos de resulterande fibrerna38. En lösning är att polymerisera en ledande monomer på ytan av en dielektrisk fiber, vilket resulterar i god mekanisk styrka och elektriska egenskaper hos slutprodukten38. Ett exempel är att täcka silkeselektrospunfibrer med den halvledande PEDOT-PSS39. Kombinationen av mekaniska och elektromagnetiska signaler accelererar neurittillväxtenavsevärt 40,41,42. Neuriter följer ställningsfiberjustering och försträcker mer efter exponering för en EF parallellt med fibrerna än till en vertikal43. På samma sätt främjar anpassningen av fibrösa byggnadsställningar till EF också myogen mognad33.
ECM består huvudsakligen av fibrösbildandeproteiner 44, av de kollagen typ I är den viktigaste beståndsdelen i alla djurvävnader förutom brosk (rik på kollagen typ II)44. Tropocollagen (TC), trippel spiralformning av polypeptidsträngar, är det strukturella motivet hos kollagenfibriller45. Transmissionselektronmikroskopi och atomkraftmikroskopibilder av kollagenfibriller visar ett D-periodiskt bandatmönster 46 som förklaras av Hodge & Petruska-modellen47 som regelbundna matriser av TC-luckor och överlappningar45. Senor består av en justerad kollagenfibrillär matris avskärmad av en icke-kollagenös mycket hydrofil proteoglykanmatris48,49. Dekorin är en liten leucinrik proteoglykan (SLRP) som kan binda gapregionerna i kollagenfibriller och ansluta till andra SLRPs genom sina glykosaminoglykan (GAG)sidokedjor 49. Studier gjorda på senor visar att deras elektriska egenskaper förändras avsevärt närhydratiserade 50,51, laddningstransportmekanism som ändras från protonisk till jonisk när hydreringsnivånökar 51. Detta tyder på att elektrisk ledning längs en kollagen typ I fibril kan aktiveras av en Decorin-vatten kappa, med gap och överlappa regioner med olika elektriska ledningskrafter och dielektriska konstanter.
Eftersom identisk rekreation av ECM av konstgjorda byggnadsställningar är osannolik, verkar den kunskap som producerar synergi mellan in vivo och in vitro som möjliggörs av översättningsbara resultat vara i en återvändsgränd. I silico modellering inte bara åter möjliggör översättning mellan de två, men också tillför viktiga fördelar i karakterisering av de okända processer som är involverade i ES. Att jämföra in vivo-observationerna med in vitro kan ge information om kopplingsstyrkan mellan målvävnaden och resten av organismen men avslöjar inte aktuella kunskapsgränser. Det okända kan exponeras genom att observera skillnaden mellan vad som förväntas hända baserat på aktuell kunskap och vad som händer. I silico experiment baserade på matematisk modellering tillåter uppdelning av processen i kända och okända delprocesser. På så sätt kommer fenomen som inte redovisas i modellen fram i ljuset när i silico-förutsägelser jämförs med in vitro- och in vivo-experiment.
Att bilda och testa hypoteser om den underliggande mekanismen/mekanismen för hur celler och vävnader påverkas av elektriska fält hindras av det stora antalet parametrar52 som måste testas separat. För att definiera representativa experimentella förhållanden måste ES-processen delas upp i delprocesser (figur 1) och dominerande ingångssignaler som påverkar cellbeteendet måste identifieras. Modeller som representerar grundläggande fysiska effekter av ES på celler beskriver den domän som parar EF med cellen – den för laddade partiklar53. Beteendet hos partiklar som är yttre till cellen beror på mikromiljön och kan undersökas separat från cellen. Den dominerande ingångssignalen för cellen är delmängden av ES-enhetens utgångar som orsakar den största variabiliteten i cellsvaret. Den minsta delmängden av de fullständiga experimentella parametrarna som kan generera variationer i alla dominerande cellinmatningssignaler kan användas för att minska parameterrymddimensionen och antalet testfall.
Indata från den biologiska ES-målmodellen måste vara en delmängd av de utgångssignaler som produceras av ES-enheten och som är användbara för att beskriva ES fysiska effekter på celler. En enkel bioreaktor med direktkoppling har samma struktur som elektrolytiska elektrokemiska celler. Modeller av dessa visar den primära (redovisning för lösningsresistens), sekundär (även redovisning av faradiska reaktioner) eller tertiär (även redovisning av jonspridande) strömtäthetsfördelning. Eftersom komplexitet översätts till beräkningskostnad är den enklaste modellen mest lämplig för parameterrymdutforskningar. Simuleringar av fibrösa kompositer motiverade avmaterialegenskaper 54 fokuserar på bulkmaterialegenskaper till följd av komplex mikroarkitektur, och kan därför inte beskriva lokala effekter av EXPONERING FÖR EF. Existerande i silico modeller, motiverade av ES, fokusera på det biologiska provet, var det en enda cell nedsänkt i ett homogent medium55,56,57, eller komplexa vävnader med homogent extracellulärt utrymme58. Laddning och strömtäthet (figur 2) kan fungera som gränssnittssignaler mellan modeller av ES-enheten och det biologiska provet, eller mellan olika komponenter i ES-enheten. Det föreslagna FEM-baserade protokollet använder de ekvationer som beskrivs i figur 2 och användes för att studera hur byggnadsställningar beroende parametrar kan användas för att modulera dessa två signaler, oberoende av ef som genereras av en direkt kopplings inställning. Resultaten betonar att det är nödvändigt att ta hänsyn till byggnadsställningar eller ECM elektriska egenskaper när man undersöker hur ES påverkar målceller.
I det föreslagna protokollet föreslås en enhetlig modelleringslösning för naturliga och konstgjorda byggnadsställningar och behovet av att beakta nanostrukturen hos fibrösa byggnadsställningar vid inspektion av effekterna av EF på celler som sås på sådana material. Även om en grov approximation för EF-intensiteten (elektrodpotentialskillnad dividerad med avståndet mellan elektroderna) skulle leda till att vi förväntar oss en fältstyrka på 100 mV/mm, förutspår simuleringar stationära fältstyrkor upp till 30% högre i olika delar av mattan (figur 5). Detta resultat bör vara av intresse för ES-experimentdesign och datatolkning, eftersom celldöd kan orsakas av alltför starka EU-fonder. Att exponera den elektriska mikromiljön skulle möjliggöra en direkt korrelation mellan ES och cellulär utveckling. Medan flera studier presenterar detaljerad morfologianalys av de användabyggnadsställningarna 33,43,59, undersöker de inte samspelet mellan materialens struktur, elektriska egenskaper och EF. Detta protokoll kan möjliggöra denna länk, eftersom parametrar som fiberradie, beläggningsskikttjocklek, avstånd mellan fibrer och elektriska egenskaper hos komponentmaterialen kan ändras enligt varje experiment genom att ändra de globala definitionerna i steg 1.2 och 1.3. Därför kan anpassade 3D-rumsligt lösta laddnings- och strömdensitetsprognoser göras för både statiska och dynamiska ES-regimer.
Byggnadsställningsdesignoptimering kan riktas genom RNC- och RNCd-modellerna med omfattande parameterområdesutforskningar, skalning av de föreslagna morfologierna eller delar av dem. Alternativt kan andra byggnadsställningar undersökas med det föreslagna protokollet genom att ändra matristyperna från linjära till tredimensionella i avsnitt 1.6.5 och anpassa ställningsgeometrin i avsnitt 1.6.2. Optimering av byggnadsställningar kan dock inte göras utan ett mål. Medan för vävnadstekniska ändamål är huvudfokus cellens öde, är en tydligare bild av vilka stimuli dess viktigaste bestämningsfaktorer avgörande om dess tillförlitliga kontroll önskas. Laddning och strömtäthet är bra deskriptorer av cellulära elektriska mikromiljöer eftersom de visar samspelet mellan EF och de elektriska egenskaperna hos de olika komponentmaterialen i komplexa byggnadsställningar som ECM. Protokollet visar hur man beräknar förutsägelser för dessa mätvärden med tanke på en nanofibrous ställnings geometri och belyser vikten av fibrers inriktningsvinkel med EF. Förutsägelser om laddning och strömtäthet kan då kopplas till cellulär utveckling och därför kan ställnings- och ES-system sedan optimeras för specifika uppgifter.
Intressant nog visar en studie att EXPONERING AV EF genererade mekanisk stress mer än dubbelt så stark i kompositfilmer med nanofibrer vinkelrätt mot den externa EF jämfört med filmer med parallellinriktning 60. Den rapporterade mekaniska stressen kan vara ett resultat av coulombkrafter som verkar mellan laddade fibrer, förutspådda av de grova modellsimuleringarna (RC, RNC, RNCd) (Figur 6). Även om dessa simuleringar kan vara användbara för att undersöka denna hypotes, måste det noteras att de rapporterade experimentella resultaten erhölls i ett system med kapacitiv koppling, och simuleringen presenterar direkt koppling.
En begränsande faktor för framtida möjliga användningar av protokollet för att uppskatta en cellulär ingångssignal är parameterosäkerhet. Geometriska osäkra parametrar är beläggningsskiktets tjocklek och avståndet mellan fiberkärnor. Den första kan härledas genom att hitta det värde som leder till en bulkimpedans som kan valideras experimentellt. Den andra kan extraheras från högupplösta materialskanningar. Parametrar som beskriver materialens fysiska egenskaper påverkas också av osäkerhet. Den elektriska konduktiviteten och dielektriska konstanten av exemplifierade material skiljer sig dock mycket mer än experimentell mätprecision(tabell 2). De rapporterade effekterna skulle därför bibehållas trots måttliga mätfel.
Resultaten visar hur inte tillräckligt med modell komplexitet kan dölja relevant information. Det är viktigt att erkänna att protokollet simulerar en förenklad version av det fysiska fenomen som äger rum eftersom det inte tar hänsyn till den olika karaktären hos material som är involverade i processledaren (elektroderna), halvledaren (beläggningen), dielektriska (fiberkärnor) och elektrolytiska (omgivande substans) – som kan påverka laddningstransporten. Denna fråga kan förklaras i framtida modellexpansioner genom att lägga till energiöverföringsfördröjningar vid gränssnitten (dvs. Faradic-reaktioner) och jontransportförseningar inom elektrolyten. Att lägga till komplexitet bör dock vägledas av experimentell validering, eftersom en enkel modell som reproducerar det mesta av det som observeras är mer användbar än en anmärkningsvärt exakt modell som lägger till lite mer information men är djupt känslig för många ingående parametrars osäkerhet.
Eftersom slutmålet med vävnadsteknik är att skapa bioreaktorer som inte bara efterliknar en eller två aspekter av in vivo-miljöer, utan replikerar och kontrollerar alla cellulära utvecklingssignaler61, elektromagnetiska och mekaniska i silico-modeller samt modeller för värmeöverföring mellan bioreaktorkomponenter måste kombineras. I en efterföljande modelleringsfas kan kopplingsfenomen mellan dessa interaktioner som ohmisk uppvärmning, elektrolytiskt vätskeflöde, morfologiska ställningsdeformationer som svar på elektrisk stimulering60 och piezoelektritet62 också läggas till. Modeller bör dock slås samman först efter att var och en har validerats experimentellt. På så sätt kan vi få en bättre förståelse för varje komponents inflytande i cellulär mikromiljö och hur stimuli kan optimeras.
Om den föreslagna modellen valideras experimentellt kan den kombineras med modeller av biologiska celler – figur 1. Laddningsdensitetsmönster och modulering kan asymmetriskt påverka specifika jonpumpars aktivitet, påverka fastsättningen på fibern av proteiner som driver membran vidhäftning63 och därmed vägleda migration, spridningsmönster och morfogenes64. Att utforska dessa hypoteser är vägen framåt när det gäller att förstå de mekanismer som ligger till grund för vävnads- och cellsvar på ES.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det 4-åriga Wellcome Trust-doktorandprogrammet i kvantitativ & biofysisk biologi
Comsol multiphysics 5.2 AC/DC module | COMSOL | – | FEM modelling software |