Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator
Summary
Viele Merkmale der Insekten-Eusozialität beruhen auf der Kommunikation innerhalb der Kolonie und der Arbeitsteilung. Die genetische Manipulation wichtiger regulatorischer Gene in Ameisenembryonen durch Mikroinjektion und CRISPR-vermittelte Mutagenese liefert Einblicke in die Natur altruistischen Verhaltens bei eusozialen Insekten.
Abstract
Die einzigartigen Merkmale eusozialer Insekten, wie Sozialverhalten und reproduktive Arbeitsteilung, werden durch ihr genetisches System gesteuert. Um zu untersuchen, wie Gene soziale Merkmale regulieren, haben wir mutierte Ameisen entwickelt, indem wir den CRISPR-Komplex in junge Embryonen während ihres Synzytialstadiums abgegeben haben. Hier stellen wir ein Protokoll der CRISPR-vermittelten Mutagenese in Harpegnathos saltator zur Verfügung, einer ponerinen Ameisenart, die eine auffällige phänotypische Plastizität aufweist. H. saltator Ameisen werden leicht in einer Laborumgebung aufgezogen. Embryonen werden für die Mikroinjektion mit Cas9-Proteinen und in vitro synthetisierten kleinen Guide-RNAs (sgRNAs) mit hausgemachten Quarznadeln gesammelt. Embryonen nach der Injektion werden außerhalb der Kolonie aufgezogen. Nach dem Schlüpfen der ersten Larve werden alle Embryonen und Larven mit einigen Pflegekräften zur weiteren Entwicklung in einen Nistkasten transportiert. Dieses Protokoll eignet sich zur Induktion der Mutagenese zur Analyse der kastenspezifischen Physiologie und des Sozialverhaltens bei Ameisen, kann aber auch auf ein breiteres Spektrum von Hautflüglern und anderen Insekten angewendet werden.
Introduction
Die Entwicklung der Eusozialität bei Insekten, insbesondere bei den Ordnungen Hymenoptera und Blattodea (früher Isoptera), hat zu einzigartigen und oft anspruchsvollen Verhaltensmerkmalen geführt, die sich sowohl auf individueller als auch auf Kolonieebene manifestieren. Die reproduktive Arbeitsteilung, ein Merkmal, das die fortgeschrittensten Gruppen sozialer Insekten charakterisiert, beinhaltet oft Kastensysteme, die aus mehreren verhaltensmäßig und oft morphologisch unterschiedlichen Gruppen bestehen. Diese Verhaltens- und morphologische Vielfalt zwischen den Kasten wird nicht nur durch ihr genetisches System, sondern oft auch durch die Umwelt gesteuert 1,2,3,4, was eusoziale Insekten zu attraktiven Subjekten für genetische und epigenetische Forschung macht.
Die Fähigkeit, das genetische System eusozialer Insekten zu manipulieren, hat sich als Herausforderung erwiesen, da sich viele Arten im Labor nicht paaren und vermehren. Die meisten eusozialen Insekten haben auch sehr wenige reproduktive Individuen in einer Kolonie, was die Anzahl der Nachkommen, die produziert werden können, begrenzt und folglich die Stichprobengröße für genetische Manipulation begrenzt5. Darüber hinaus haben viele eusoziale Insekten eine lange Generationszeit im Vergleich zu Insekten, die üblicherweise für genetische Studien verwendet werden (wie Drosophila), was die Schwierigkeit, genetische Linien zu etablieren, erschwert5. Einige eusoziale Arten können jedoch einen großen Anteil an reproduktiv aktiven Individuen in einer Kolonie erzeugen, was die Herausforderungen lindert und Möglichkeiten bietet, mutierte oder transgene Linien zu etablieren.
Im Falle der ponerinen Ameisenart, Harpegnathos saltator, können alle Arbeiterinnen nach dem Tod einer Königin oder sozialer Isolation fortpflanzungsaktiv werden. Diese Arbeiter werden als “Gamergates” bezeichnet und können verwendet werden, um neue Kolonien zu generieren6. Darüber hinaus kann es mehr als ein Gamergate in einer Kolonie geben, wodurch die Nachkommenproduktion 5,7,8 erhöht wird. Bisher wurden mutierte und/oder transgene Linien bei der europäischen Honigbiene, Apis mellifera, und bei den Ameisenarten H. saltator, Ooceraea biroi und Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 entwickelt. . Genetische Analysen bei sozialen Bienen und Ameisen haben den Weg zu einem besseren Verständnis der Eusozialität geebnet und bieten eine Reihe von Möglichkeiten, Gene und ihre Auswirkungen auf eusoziales Insektenverhalten und kastenspezifische Physiologie zu untersuchen.
Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung über das CRISPR/Cas9-System in H. saltator zur Verfügung. Insbesondere wurde diese Technik verwendet, um eine Keimbahnmutation in Orco zu erzeugen, dem Gen, das den obligaten Co-Rezeptor aller Geruchsrezeptoren (ORs) kodiert10. OR-Gene wurden in eusozialen Hymenopteren-Insekten bemerkenswert erweitert16, und ORCO spielt eine wesentliche Rolle bei der Geruchswahrnehmung von Insekten; in seiner Abwesenheit montieren sich OPs nicht oder funktionieren nicht normal. Mutationen des Orco-Gens stören daher die olfaktorische Empfindung, die neuronale Entwicklung und das damit verbundene soziale Verhalten 9,10.
In diesem Protokoll werden Cas9-Proteine und kleine Guide-RNAs (sgRNAs) mittels Mikroinjektion in Ameisenembryonen eingeführt, um die Mutagenese eines Zielgens zu induzieren. Hier werden wir das Mikroinjektionsverfahren im Detail beschreiben, zusammen mit Anweisungen zur Pflege von Kolonien und injizierten Embryonen. Diese Methoden eignen sich zur Induktion der Mutagenese in einer Vielzahl verschiedener Gene bei H. saltator-Ameisen und können auf ein breiteres Spektrum von Hautflügler-Insekten angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung der Eusozialität bei Insekten, einschließlich Ameisen, Bienen, Wespen und Termiten, hat zum Auftreten neuer Verhaltens- und morphologischer Merkmale geführt, von denen viele durch eine Kombination von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst werdensollen 1,2,3,4. Leider wurde die Attraktivität und Nützlichkeit eusozialer Insekten als Forschungsmodelle auf dem Gebiet der…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Labors von Danny Reinberg und Claude Desplan an der New York University und Jürgen Liebigs Labor an der Arizona State University für ihre Unterstützung bei der Ameisengenetik. Hua Yan dankt der National Science Foundation I/UCRC, dem Center for Arthropod Management Technologies unter der Fördernummer IIP-1821914 und von Industriepartnern. Maya Saar wurde vom United States – Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19 unterstützt.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
Riferimenti
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
