Dette manuskript beskriver en metode til målrettet levering til en enkelt nyre via et kateter placeret i infrarenal abdominal aorta i musen.
Der er behov for direkte injektioner for at muliggøre øget og specifik nyreeksponering for effektiv evaluering af narkotikamål på nyreforskningsområdet. Akkumulering af lægemidler i visse organer kan give anledning til negative og uønskede virkninger, afhængigt af intravenøst stofbrug. For at minimere afsmittende virkninger og/eller akkumulering i andre væv dirigerer den heri beskrevne metode formuleringen ind i nyrepulsårens blodbanen ved at indsætte et kateter i infra renal aorta, lige under hvor det forgrener sig i nyrepulsåren, hvilket resulterer i nyrerne som først nået organ og distribution af formulering i hele nyrerne.
Dette manuskript giver en detaljeret beskrivelse af metoden samt dens udfordringer og vanskeligheder. Det guider eksperimentatoren til at blive dygtig med denne type mikrokirurgi, der kræver nøjagtighed under sterile forhold. Hastighed er afgørende for at minimere iskæmi og praktisere proceduren vil øge chancen for vellykkede injektioner uden bivirkninger. Ved at modulere tiden mellem injektion og genfusion samt det injicerede volumen mindskes risikoen for afsmitning til andre organer.
Bemærk, at denne teknik er velegnet til enkelt doseringsstrategier.
På det prækliniske forskningsfelt inden for medicinalindustrien er model- og metodeudvikling en del af det daglige arbejde. Der er en stigende interesse for evnen til at dirigere lægemidler til bestemte organer, eller endda separate rum i et organ, uden større spillover / entrapment, via blodbanen, i andre væv. Dette for at muliggøre øget og specifik eksponering for effektiv evaluering af narkotikamål i modeller af forskellige sygdomsområder 1,2,3,4.
En almindelig måde at levere stoffer på er ved hjælp af systemiske ruter (f.eks. via haleåren), da det er mindre invasivt end den metode, der er beskrevet i dette manuskript. Systemisk indgift øger imidlertid risikoen for øget metabolisme eller akkumulering af forbindelsen i andre væv end det tilsigtede målorgan, når de passerer gennem filtreringsorganer som lungerne, leveren og milten 2,3,5. Bortset fra ikke at nå det bestemt væv, kan dette potentielt give anledning til negative og / eller uønskede virkninger, afhængigt af arten af injicerat. Kun meget små molekyler passerer kapillærerne i filtreringsorganer, og derfor er målrettet levering særlig vigtig, hvis man arbejder med større molekyler 6.
For at minimere spillover og / eller ophobning af injiceret formulering, i andre væv, den heri beskrevne metode dirigerer formuleringen ind i nyrepulsåren blodbanen gennem et kateter indsat i abdominal aorta lige under, hvor det grene ind i nyrepulsåren, hvilket resulterer i nyrerne som først nået organ. En anden fordel ved denne styrede indgift er, at der kan anvendes en lavere dosis/volumen for at opnå det samme eksponeringsniveau som ved systemisk indgift 3.
Andre indgiftsveje er blevet undersøgt, for eksempel injektioner via et kateter direkte ind i nyrepulsåren. I vores hænder viste dette sig at udgøre en højere risiko for manglende gendannelse af cirkulationen til nyrerne. Nyrepulsårens meget lille diameter (ca. 0,35-0,55 mm i diameter) gør snittet relativt stort og udgør en risiko for obstruktion og/eller blodprop, når indgangshullet lukkes. Ifølge vores erfaring opstod der ofte iskæmisk-relateret skade på nyrerne, når vi brugte denne metode, og vi udviklede derfor denne nye måde at målrette nyrerne på ved at injicere stoffer gennem indsnit i den større aorta for at målrette nyrerne.
Der er lignende teknikker, der udvikles hos rotter, der også manifesterer udfordringerne og risikoen for stenose / trombose, der arbejder med injektioner direkte ind i nyrepulsåren 5. Dette understøtter vores resultater, da fartøjerne i mus er endnu mindre.
Dette manuskript og video beskriver i detaljer, hvordan injektioner kan ledes ind i nyrepulsåren hos mus gennem et kateter indsat i infrarenal aorta, samt vejledning i, hvordan man overvinder fælles vanskeligheder i proceduren, at arbejde på den sikreste måde muligt og derved øge reproducerbarheden.
Denne metode har haft succes med at levere formuleringer til nyrerne uden at forårsage nyreskader. Det kan bruges til levering af enhver form for formuleringer (f.eks små molekyler, stamceller / stamceller, eller mikrovesicles). Metoden kan anvendes i sunde dyr eller i nyresygdomsmodeller.
I figur 2 og figur 3præsenteres histologien. Figur 2 viser histologi 180 minutter efter perfusion, mens figur 3 viser historien 7 dage efter infusionen. Årsagen til dette er, at eksperimenterne med nyrearterie kun var 180 minutter lange. For at være sikker på, at vi ikke havde nogen kronisk skade med denne nye metode, ventede vi med vilje 7 dage på at evaluere dem. N-tallet er lille, men dette er blot et eksempel.
Bemærk, at denne nyudviklede metode til aorta administration til at målrette nyrerne er en invasiv metode med relativt lav gennemstrømning og er kun egnet til enkelt doseringsstrategier. Gentagen dosering er ikke mulig med denne metode.
Med mindre justeringer af ligaturplaceringerne kunne denne metode muligvis bruges til at tilføre begge nyrer simultaniously5,7. Med den øgede risiko for spillover gennem aorta forgrening besluttede vi at holde okkluderende ligatur så tæt på nyrerne som muligt, hvilket fører injektionen til venstre nyre kun. Det kan også bruges i tillæg til andre modeller eller teknikker som uninephrectomy eller måske endda samtidig nyreiskæmi reperfusion skade (IRI). Efter vores mening er injektionen kun 24 timer efter IRI3-operationen for hård og vil påvirke dyrets genopretning betydeligt.
Når man bruger nye musstammer, bør man altid udføre et pilotforsøg på nogle dyr fra denne stamme for at sikre, at metoden ikke behøver at blive justeret på en eller anden måde. For eksempel kan karforgreningen fra aortaen i nogle stammer placeres lidt anderledes. Ligaturernes position kan ændre sig noget for at sikre, at formuleringen ender på det rigtige sted.
Dehydrering
Åbning af bughulen udgør en stor risiko for dehydrering. Det er derfor bydende nødvendigt at tilsætte væsker (ca. 37 °C) både under og efter operationen for at sikre et godt grundlag for nyttiggørelse post operatively. Vi plejer at give 1 mL/mus s.c. efter operationen.
Iskæmi
Forlænget operationstid, eller hvis det ikke lykkes at opnå fuld recirkulering, vil det resultere i iskæmi. Det er vigtigt at registrere den faktiske iskæmi tid og sørg for, at omsætning til nyrerne (og bagbenene) er genoprettet. Konstant træning og forfriskende færdigheder er som altid vigtigt. Udførelse af proceduren hurtigere reducerer den tid, nyrerne udsættes for iskæmi. At holde iskæmitiden (ligation af aorta) til ca. 5 min (10 min max) har vist sig ikke at skade nyrerne.
Afsmitning
I betragtning af risikoen for afsmitning til andre organer, når den injicerede formulering igen kommer i omløb gennem nyreåren, bør det injicerede volumen holdes på et minimum. Vi anbefaler et maksimalt volumen på 50 μL. Dosering har også af andre vist sig at være en kritisk faktor for effektivitet3.
Bivirkninger (trombose og lammelse)
I første omgang, når du opretter den model, vi oplevede ikke-konsekvente problemer med lammelse i bagbenene. Efter relevant dosis antikoagulant (10 IE heparin i haleåren) præoperativt blev denne skadelige virkning signifikant reduceret. Efter at have konsulteret eksperter på området begyndte vi også at være endnu mere forsigtige med at arbejde med atraumatisk kirurgi, hvilket betyder, at vi ikke klemmede i væv og rørte så lidt områder som muligt. Disse foranstaltninger reducerede tilsammen hyppigheden af lammelse fra ca. 50 % til næsten ingen.
I første omgang under metodeudvikling anvendte vi antikoagulerende væv på nyrearterien for at lukke snithullet. Dette var ikke muligt, når du foretager injektioner i aorta, da trykket er så meget højere i aorta. Antikoagulant øger også risikoen for trombose, hvis det kommer ind i fartøjet lumen.
Sørg for ikke at have adventitia udsat i aortaens lumen, når du syr siden adventitia er meget thrombogenic. Undgå også at vende sårkanter eller indsnævre aorta ved at suturere til låret.
Vi har nu en etableret metode til at levere formuleringer direkte til nyrerne.
The authors have nothing to disclose.
Tak til René Remie hos RRSSC for at hjælpe mig med at finjustere teknikken og Instech labs til samarbejde om at producere et specialdesignet kateter. En stor tak også til alle kolleger hos AstraZeneca R&D for produktive diskussioner med tips og tricks samt Xerox for at færdiggøre videoen med lyd.
Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |