ゼブラフィッシュで長期高血糖を生み出すグルコースの交互浸漬
Summary
このプロトコルは、ゼブラフィッシュの高血糖を最大8週間非侵襲的に誘導する。このプロトコルを用いて、高血糖の副作用に関する詳細な研究が行われる。
Abstract
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、慢性高血糖症の影響を調査するための優れたモデルであり、II型糖尿病(T2DM)の特徴である。この交互浸漬プロトコルは、最大8週間の高血糖を誘導する非侵襲的で段階的な方法である。成虫のゼブラフィッシュは、それぞれ24時間砂糖(ブドウ糖)と水に交互に曝されます。ゼブラフィッシュは、2週間1%のグルコース溶液で治療を開始し、その後2週間、そして最後に残りの4週間の3%溶液を2%溶液とする。水処理(ストレス)およびマンニトール処理(浸透)コントロールと比較して、グルコース処理ゼブラフィッシュは血糖値が有意に高い。グルコース処理されたゼブラフィッシュは、コントロールの3倍の血糖値を示し、4週間と8週間後の高血糖が達成できることを示唆している。持続的な高血糖は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の増加と、陰性および生理学的応答の減少における核因子カッパB(NF-kB)レベルの増加と関連しており、このプロトコルが疾患合併症をモデル化するために使用できることを示唆する認知障害であった。
Introduction
ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、病気と認知の両方を研究するために広く使用される動物モデルになりつつあります1.初期の発達段階を通じた遺伝子操作と胚性の透明性の容易さは、既知の遺伝的基礎を持つヒト疾患を研究する最有力候補となる。例えば、ゼブラフィッシュは、ホルト・オラム症候群、心筋症、糸球嚢胞性腎疾患、筋ジストロフィー、および糖尿病(DM)の研究に使用されてきた。また、ゼブラフィッシュモデルは、種の小型、メンテナンスの容易さ、および高い胎児性2、3のために理想的です。
ゼブラフィッシュ膵臓は、哺乳類膵臓4と解剖学的および機能的に類似している。したがって、サイズ、高い胎児性、および類似の内分泌構造のユニークな特性は、ゼブラフィッシュをDM関連合併症を研究するための適切な候補にする。ゼブラフィッシュでは、DMに特徴的な長期高血糖を誘導するために用いられる2つの実験方法があります:グルコースの流入(モデリングタイプ2)とインスリン分泌の停止(モデリングタイプ1)5、6。実験的に、インスリン分泌を止めるために、膵臓β細胞は、ストレプトゾトシン(STZ)またはアロキサン注射のいずれかを使用して化学的に破壊することができる。STZは齧歯類およびゼブラフィッシュで正常に使用され、網膜症7、8、9、認知障害10、および四肢再生11に関連する合併症を生じさせる。しかし、ゼブラフィッシュでは、β細胞が治療後に再生し、糖尿病状態12を維持するためにSTZの「ブースター注射」が必要となる。あるいは、ゼブラフィッシュの膵臓を6から取り除くことができる。これらは、複数の注射、および広範な回復時間のために、両方の非常に侵襲的な手順です。
逆に、高血糖は、外因性グルコースへの暴露を通じて非侵襲的に誘発され得る。このプロトコルでは、魚は24時間5、13、または2週間14、15、16のために継続的に高濃度グルコース溶液に沈められます。外因性グルコースは、経口摂取によって、および/またはエラを横切って、血糖値の上昇をもたらす経皮的に取り上げられる。この非侵襲的な技術はインスリンレベルを直接操作しないので、タイプ2 DMを誘導するとは主張できない。しかし、これは、タイプ2 DMの主な症状の一つである高血糖によって誘発される合併症を調べるために使用することができる。
最近、ゼブラフィッシュ変異体pdx1-/-は、ヒトにおける2型DMの遺伝的原因に関連する遺伝子である膵臓および十二指腸ホメオボックス1遺伝子を操作することによって開発された。この変異体を用いて、研究者は膵臓発達破壊、高血糖、および高血糖誘発糖尿病網膜症17,18を複製することができた。
本論文では、交互浸漬プロトコルを用いた非侵襲性高血糖誘導法について述べている。このプロトコルは、その後の合併症が観察された最大8週間の高血糖状態を維持する。簡単に言えば、成虫のゼブラフィッシュは24時間砂糖溶液に入れられ、次いで24時間水溶液に入れられます。外部グルコース溶液への連続浸漬とは対照的に、砂糖と水の間の交互の日は、糖尿病における血糖値の上昇と下降を模倣する。交互のグルコースプロトコルは、高血糖を高血糖が高い外部グルコース条件を補うことができないほど長い期間誘発することをさらに可能にする。原理の証明として、このプロトコルを用いて誘発される高血糖が、レチナリカル化学と生理学を変えるデータを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
糖尿病は全国的な問題です。研究によると、2030年までに推定4億人が何らかの糖尿病を患うだろう。げっ歯類モデルでは、遺伝子操作を用いて2型DMを研究する。ラットでは、ザッカー糖尿病性ラット(ZDF)、及び大塚ロングエバンス徳島脂肪ラット(OLETF)が、2型DM10の効果に関するより多くの情報を提供している。また、高血糖を誘発するためにげっ歯類にも高脂肪食が使用され…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの開発については、VPC、CJR、および MCP を認識したいと考えています。EMMは、この研究を行うために、アメリカン大学芸術科学大学大学院学生支援から資金援助を受けました。この作品はまた、アメリカン大学教員メロン賞とアメリカン大学芸術科学大学を通じて資金を提供することによってサポートされました (両方の VPCへ).
Materials
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
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