Immersione alternativa nel glucosio per produrre iperglicemia prolungata in Zebrafish

Summary

Questo protocollo induce in modo non invasivo l’iperglicemia nel pesce zebra per un massimo di 8 settimane. Utilizzando questo protocollo, è possibile fare uno studio approfondito degli effetti avversi dell’iperglicemia.

Abstract

I pesci zebra (Danio rerio) sono un modello eccellente per indagare gli effetti dell’iperglicemia cronica, un segno distintivo del diabete mellito di tipo II (T2DM). Questo protocollo ad immersione alternativa è un metodo non invasivo e step-wise per indurre iperglicemia per un massimo di otto settimane. I pesci zebra adulti sono alternativamente esposti allo zucchero (glucosio) e all’acqua per 24 ore ciascuno. Il pesce zebra inizia il trattamento in una soluzione di glucosio all’1% per 2 settimane, quindi una soluzione al 2% per 2 settimane e infine una soluzione al 3% per le restanti 4 settimane. Rispetto ai controlli trattati con acqua (stress) e trattati con mannitolo (osmotico), i pesci zebra trattati con glucosio hanno livelli significativamente più elevati di zucchero nel sangue. Il pesce zebra trattato con glucosio mostra livelli di zucchero nel sangue 3 volte superiori a quello dei controlli, suggerendo che dopo quattro e otto settimane l’iperglicemia può essere raggiunta. L’iperglicemia sostenuta è stata associata all’aumento della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e all’aumento dei livelli di fattore nucleare Kappa B (NF-kB) nella retina e alla diminuzione delle risposte fisiologiche, così come i deficit cognitivi che suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per modellare le complicanze della malattia.

Introduction

Il pesce zebra(Danio rerio)sta rapidamente diventando un modello animale ampiamente utilizzato per studiare sia la malattia che la cognizione^1. La facilità di manipolazione genetica e la trasparenza embrionale attraverso le prime fasi di sviluppo, li rendono un candidato principale per studiare le malattie umane con una base genetica nota. Ad esempio, i pesci zebra sono stati utilizzati per studiare la sindrome di Holt-Oram, le cardiomiopatie, la malattia renale glomerulocistica, la distrofia muscolare e il diabete mellito (DM) tra le altre^{malattie 1}. Inoltre, il modello zebrafish è ideale per le piccole dimensioni della specie, la facilità di manutenzione e l’elevata fecondità^2,3.

Il pancreas zebrafish è sia anatomicamente che funzionalmente simile al pancreas di mammiferi⁴. Pertanto, le caratteristiche uniche di dimensioni, alta fecondità e strutture endocrine simili rendono zebrafish un candidato adatto per lo studio delle complicanze legate alla DM. Nel pesce zebra, ci sono due metodi sperimentali utilizzati per indurre l’iperglicemia prolungata che è caratteristica del DM: un afflusso di glucosio (modellazione di tipo 2) e la cessazione della secrezione di insulina (modellazione tipo 1)^5,6. Sperimentalmente, per fermare la secrezione di insulina, le cellule β pancreatiche possono essere distrutte chimicamente usando iniezioni di Streptozotocina (STZ) o Alloxan. STZ è stato utilizzato con successo nei roditori e nei pesci zebra, con conseguenti complicazioni associate alla retinopatia^7,8,9,deficit cognitivi¹⁰e rigenerazione degli arti¹¹. Tuttavia, nel pesce zebra, β-cellule si rigenerano dopo il trattamento, causando la necessaria “iniezione di richiamo” di STZ per mantenere le condizioni diabetiche¹². In alternativa, il pancreas del pesce zebra può essere rimosso⁶. Si tratta sia di procedure altamente invasive, dovute alle iniezioni multiple, sia di un ampio tempo di recupero.

Al contrario, l’iperglicemia può essere indotta in modo non invasivo attraverso l’esposizione al glucosio esogeno. In questo protocollo, i pesci sono immersi in una soluzione di glucosio altamente concentrata per 24 ore^5,13 o continuamente per 2 settimane^14,15,16. Il glucosio esogeno viene assunto transdermicamente, per ingestione e/o attraverso le branchie con conseguente elevati livelli di zucchero nel sangue. Poiché questa tecnica non invasiva non manipola direttamente i livelli di insulina, non può pretendere di indurre il DM di tipo 2. Tuttavia, può essere utilizzato per esaminare le complicanze indotte dall’iperglicemia, che è uno dei principali sintomi del DM di tipo 2.

Recentemente, il mutante zebrafish pdx1^{-/- è} stato sviluppato manipolando il gene pancreatico e duodenale omeobox 1, un gene legato alla causa genetica del DM di tipo 2 nell’uomo. Utilizzando questo mutante, i ricercatori sono stati in grado di replicare l’interruzione dello sviluppo pancreatico, l’alto livello di zucchero nel sangue e studiare la retinopatia diabetica indotta da iperglicemia^17,18.

In questo articolo, descriviamo un metodo di induzione dell’iperglicemia non invasiva che utilizza un protocollo ad immersione alternata. Questo protocollo mantiene condizioni iperglicemiche per un massimo di 8 settimane con complicazioni successive osservate. In breve, i pesci zebra adulti vengono posti in una soluzione di zucchero per 24 ore e quindi in una soluzione d’acqua per 24 ore. A differenza dell’immersione continua in soluzioni esterne di glucosio, alternare giorni tra zucchero e acqua imita l’aumento e la caduta della glicemia nel diabete. Un protocollo di glucosio alternato consente inoltre di indotta l’iperglicemia per periodi di tempo più lunghi, poiché i pesci zebra non sono così in grado di compensare le elevate condizioni esterne di glucosio. Come prova di principio, forniamo dati che mostrano che l’iperglicemia indotta usando questo protocollo altera la chimica retinica e la fisiologia.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’American University. 1. Preparazione dei serbatoi di soluzione Ottenere sei serbatoi, due per ogni gruppo sperimentale (glucosio, mannitolo e acqua). Etichettare uno dei due serbatoi “serbatoio di alloggiamento” (oterrà il pesce) ed etichettare l’altro “serbatoio di soluzione” (terrà la soluzione).NOTA: Il gruppo di trattamento del mannitol è il controllo osmotico e il gruppo di tratt…

Representative Results

Utilizzando questo protocollo (Figura 1), i valori della glicemia sono significativamente elevati dopo 4 settimane e 8 settimane di trattamento (Figura 2A), con iperglicemia definita come 3 volte le medie di controllo provenienti sia da gruppi trattati con acqua che da gruppi trattati con mannito. I controlli trattati con acqua vengono trasferiti ogni giorno all’interno e all’uscita dall’acqua, fornendo un controllo dello stress/movimentazione. Il mannitolo fung…

Discussion

Il diabete è un problema nazionale. Gli studi dimostrano che entro il 2030, si stima che 400 milioni di persone avranno una qualche forma di diabete. Nei modelli di roditori, il DM di tipo 2 viene studiato utilizzando la manipolazione genetica. Nei ratti, i ratti grassi diabetici Zucker (ZDF) e i ratti grassi Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), forniscono maggiori informazioni sugli effetti del tipo 2 DM¹⁰. Inoltre, diete ad alto contenuto di grassi sono state utilizzate nei roditori per indurre…

Materials

Airline Tubing	petsmart	5291863	This can be used in the tank to circulate air
Airpump	petsmart	5094984	This can be used in the tank to circulate air
Airstones	petsmart	5149683	This can be used in the tank to circulate air
D-glucose	Sigma	G8270-5KG
D-mannitol	Acros Organics	AC125340050
Freestyle Lite Meter	Amazon	B01LMOMLTU
Freestyle Lite Strips	Amazon	B074ZN3H2Z
Net	petsmart	5175115
Tanks	Amazon	B0002APZO4