कार्यात्मक और शारीरिक रूप से विभिन्न क्षेत्रों में माउस मस्तिष्क का माइक्रोडिसेक्शन
Summary
हम माउस मस्तिष्क हटाने और ताजा मस्तिष्क के ऊतकों से असतत क्षेत्रों के विच्छेदन के लिए एक हाथ पर, चरण-दर-चरण, तेजी से प्रोटोकॉल पेश करते हैं। आणविक विश्लेषण के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों को प्राप्त करना कई तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं में नियमित हो गया है। सिस्टम स्तर विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा प्राप्त करने के लिए इन मस्तिष्क क्षेत्रों को तुरंत जमे हुए हैं।
Abstract
मस्तिष्क स्तनधारी तंत्रिका तंत्र के लिए कमांड सेंटर और भारी संरचनात्मक जटिलता वाला एक अंग है। खोपड़ी के भीतर संरक्षित, मस्तिष्क में गोलार्धों पर ग्रे पदार्थ का एक बाहरी आवरण होता है जिसे सेरेब्रल कॉर्टेक्स के रूप में जाना जाता है। इस परत के नीचे कई अन्य विशेष संरचनाएं रहती हैं जो अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण कई घटनाओं के लिए आवश्यक हैं। विशिष्ट सकल मस्तिष्क क्षेत्रों के नमूने प्राप्त करने के लिए त्वरित और सटीक विच्छेदन चरणों की आवश्यकता होती है। यह समझा जाता है कि सूक्ष्म स्तर पर, कई उप-क्षेत्र मौजूद हैं और संभवतः मनमानी क्षेत्रीय सीमाओं को पार करते हैं जो हम इस विच्छेदन के उद्देश्य से लगाते हैं।
माउस मॉडल का उपयोग नियमित रूप से मानव मस्तिष्क कार्यों और बीमारियों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन रोगग्रस्त अवस्था के आधार पर एक विशेष फेनोटाइप को लक्षित करने वाले विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों तक सीमित हो सकता है। इस प्रकार, इसके अच्छी तरह से परिभाषित संरचनात्मक संगठन के संबंध में प्रतिलेखन के विनियमन का अध्ययन करना बहुत महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क की पूरी समझ के लिए अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने, कनेक्शन को परिभाषित करने और इन मस्तिष्क क्षेत्रों में से प्रत्येक की गतिविधियों में महत्वपूर्ण अंतर की पहचान करने की आवश्यकता होती है। इन अलग-अलग क्षेत्रों में से प्रत्येक की अधिक व्यापक समझ तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में नए और बेहतर उपचार का मार्ग प्रशस्त कर सकती है। यहां, हम सोलह अलग-अलग क्षेत्रों में माउस मस्तिष्क को विच्छेदन के लिए एक चरण-दर-चरण पद्धति पर चर्चा करते हैं। इस प्रक्रिया में, हमने पुरुष माउस सी 57 बीएल / 6 जे (6-8 सप्ताह पुराना) मस्तिष्क हटाने और न्यूरोएनाटोमिकल स्थलों का उपयोग करके कई क्षेत्रों में विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित किया है ताकि असतत कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक और व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान और नमूना लिया जा सके। यह काम तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक मजबूत नींव रखने में मदद करेगा, जिससे मस्तिष्क समारोह की गहरी समझ में अधिक केंद्रित दृष्टिकोण होंगे।
Introduction
रीढ़ की हड्डी और रेटिना के साथ मस्तिष्क में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र शामिल होता है जो जटिल व्यवहार को निष्पादित करता है, पूरे शरीर में विशेष, सटीक रूप से तैनात और बातचीत करने वाले सेलप्रकारों द्वारा नियंत्रित होता है 1. मस्तिष्क एक जटिल अंग है जिसमें अरबों परस्पर जुड़े न्यूरॉन्स और ग्लिया होते हैं, जिसमें सटीक सर्किटरी कई कार्य करती है। यह दो अलग-अलग लोब और विविध सेलुलर घटकों के साथ एक द्विपक्षीय संरचनाहै 2. रीढ़ की हड्डी मस्तिष्क को बाहरी दुनिया से जोड़ती है और हड्डी, मेनिन्जेस और मस्तिष्कमेरु द्रव द्वारा संरक्षित होती है और मस्तिष्क 2,3,4 से संदेश भेजती है। मस्तिष्क की सतह, सेरेब्रल कॉर्टेक्स, असमान है और इसमें अलग-अलग सिलवटें होती हैं, जिन्हें गायरी कहा जाता है, और खांचे, जिन्हें सल्सी कहा जाता है, जो मस्तिष्क को कार्यात्मक केंद्रों में अलग करते हैं5. कॉर्टेक्स स्तनधारियों में एक छोटे से मस्तिष्क 6,7 के साथ चिकनी है। विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से संबंधित विकारों के साथ-साथ इसके कार्यात्मक सर्किट को समझने के लिए मानव मस्तिष्क की वास्तुकला को चिह्नित करना और अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। हाल के वर्षों में तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान का विस्तार हुआ है और मस्तिष्क की संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक तरीकों का उपयोग किया जा रहा है। आणविक और सिस्टम-स्तरीय जीव विज्ञान के क्षेत्र में विकास ने मस्तिष्क संरचनाओं और अणुओं के कामकाज के बीच जटिल संबंधों की खोज के एक नए युग की शुरुआत की है। इसके अतिरिक्त, आणविक जीव विज्ञान, आनुवंशिकी और एपिजेनेटिक्स तेजी से विस्तार कर रहे हैं, जिससे हमें सिस्टम कैसे कार्य करने में शामिल अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने में सक्षम बनाता है। इन विश्लेषणों को अधिक प्रभावी उपचारों की जांच और विकास को लक्षित करने में मदद करने के लिए बहुत अधिक स्थानीयकृत आधार पर किया जा सकता है।
स्तनधारी मस्तिष्क को संरचनात्मक रूप से स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य असतत क्षेत्रों में परिभाषित किया गया है; हालाँकि, इन असतत संरचनाओं की कार्यात्मक और आणविक जटिलताओं को अभी तक स्पष्ट रूप से समझा नहीं गया है। मस्तिष्क के ऊतकों की बहु-आयामी और बहु-स्तरीय प्रकृति इस परिदृश्य को कार्यात्मक स्तर पर अध्ययन करना मुश्किल बनाती है। इसके अलावा, तथ्य यह है कि एक ही संरचना द्वारा कई कार्य किए जाते हैं और इसके विपरीत मस्तिष्क8 की समझ को और जटिल बनाता है। यह महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क क्षेत्रों के संरचनात्मक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए निष्पादित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण फ़ंक्शन के साथ न्यूरोएनाटोमिकल आर्किटेक्चर को सहसंबंधित करने के लिए नमूने में स्थिरता प्राप्त करने के लिए सटीक अनुसंधान पद्धतियों का उपयोग करता है। मस्तिष्क की जटिलता को हाल ही में एकल कोशिका अनुक्रमण 9,10 का उपयोग करके समझाया गया है जैसे कि मानव मस्तिष्क का लौकिक गाइरस जो 75 अलग-अलग सेल प्रकार11 से बना है। माउस मस्तिष्क के अनुरूप क्षेत्र से उन लोगों के लिए इस डेटा की तुलना करके, अध्ययन न केवल उनके वास्तुकला और सेल प्रकारों में समानता का पता चलता है, बल्कि मतभेदों को भी प्रस्तुत करता है। जटिल तंत्र को उजागर करने के लिए, इसलिए पूरी सटीकता के साथ मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। मानव और माउस मस्तिष्क के बीच संरक्षित संरचनाएं और कार्य मानव मस्तिष्क समारोह और व्यवहार परिणामों को स्पष्ट करने के लिए प्रारंभिक सरोगेट के रूप में माउस के उपयोग को सक्षम करते हैं।
सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण की उन्नति के साथ, कृन्तकों में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों से जानकारी प्राप्त करना तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया बन गई है। जबकि लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन12 जैसे कुछ प्रोटोकॉल महंगे हो सकते हैं, यांत्रिक प्रोटोकॉल सस्ते हैं और आमतौर पर उपलब्ध टूल13,14 का उपयोग करके किए जाते हैं। हमने ट्रांसक्रिप्टोमिक परख15 के लिए कई मस्तिष्क क्षेत्रों का उपयोग किया है और थोड़े समय में चरण-दर-चरण तरीके से रुचि के माउस मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए एक हाथ से और तेजी से प्रक्रिया विकसित की है। एक बार विच्छेदित होने के बाद, इन नमूनों को इन ऊतकों के न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को संरक्षित करने के लिए ठंड की स्थिति में तुरंत संग्रहीत किया जा सकता है। हमारे दृष्टिकोण को तेजी से उच्च दक्षता के लिए अग्रणी किया जा सकता है और ऊतक गिरावट के लिए कम संभावना की अनुमति देता है। यह अंततः, मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों को उत्पन्न करने की संभावना को बढ़ाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्तनधारी मस्तिष्क एक जटिल अंग है जो विभिन्न आणविक हस्ताक्षरों और कई क्षेत्रों के साथ रूपात्मक रूप से अलग और कार्यात्मक रूप से अद्वितीय कोशिकाओं की एक सरणी से बना है जो विशेष और असतत कार्य करते हैं। यह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रायोगिक सहायता के लिए सुश्री शेषमालिनी श्रीनिवासन, श्री स्टीफन बटलर और सुश्री पामेला स्पेलमैन और पांडुलिपि के संपादन के लिए सुश्री दाना यूसुफ को धन्यवाद देते हैं। यूएसएएमआरडीसी से वित्त पोषण सहायता कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार की जाती है। जिनेवा फाउंडेशन ने इस काम में योगदान दिया और अमेरिकी सेना अनुसंधान कार्यालय के माध्यम से सैन्य और परिचालन चिकित्सा अनुसंधान क्षेत्र निदेशालय III से धन द्वारा समर्थित किया गया।
अस्वीकरण:
वाल्टर रीड आर्मी इंस्टीट्यूट ऑफ रिसर्च द्वारा सामग्री की समीक्षा की गई है। इसकी प्रस्तुति और/या प्रकाशन पर कोई आपत्ति नहीं है। यहां निहित राय या दावे लेखक के निजी विचार हैं, और इसे आधिकारिक के रूप में नहीं माना जाना चाहिए, या सेना विभाग या रक्षा विभाग के सच्चे विचारों को प्रतिबिंबित करने के रूप में नहीं माना जाना चाहिए। पशु कल्याण अधिनियम और जानवरों से संबंधित अन्य संघीय क़ानूनों और नियमों के अनुपालन में एएएएलएसी मान्यता प्राप्त सुविधा में एक अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के तहत अनुसंधान आयोजित किया गया था और जानवरों से जुड़े प्रयोगों और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में बताए गए सिद्धांतों का पालन करता है, एनआरसी प्रकाशन, 2011 संस्करण।
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
Riferimenti
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