Sintesi di pirazolo dipendente dal pH, imidazolo e fluorofori di Isoindolone Dipyrrinone usando un approccio di condensazione claisen-schmidt
Summary
La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt è una metodologia importante per la generazione di composti aromatici biciclici coniugati colma di metina. Utilizzando una variante mediata dalla base della reazione aldola, è possibile accedere a una gamma di molecole fluorescenti e/o biologicamente rilevanti attraverso un approccio sintetico generalmente economico e operativamente semplice.
Abstract
I composti aromatici biciclici coniugati colma di metina sono costituenti comuni di una serie di molecole biologicamente rilevanti come porfirine, dipirrinones e prodotti farmaceutici. Inoltre, la rotazione limitata di questi sistemi spesso si traduce in sistemi altamente o moderatamente fluorescenti come osservato in 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2′,1′-f]pirimidina-3-uno, xantoglow, analoghi pirroloindolizinedione, analoghi BODIPY e sistemi ad anello fenolici e imidazolinone di Green Fluorescent Protein (GFP). Questo manoscritto descrive un metodo economico e operativamente semplice per eseguire una condensazione claisen-schmidt per generare una serie di analoghi diapirrinone dipendenti dal pH fluorescente. Mentre la metodologia illustra la sintesi degli analoghi dipirrinone, può essere tradotta per produrre una vasta gamma di composti aromatici biciclici coniugati. La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt utilizzata in questo metodo è limitata nell’ambito ai nucleofili e agli elettrofili che sono enolabile in condizioni di base (componente nucleofila) e aldeidi non enoluibili (componente elettrofilo). Inoltre, sia i reagenti nucleofili che elettrofili devono contenere gruppi funzionali che non reagiscano inavvertitamente con idrossido. Nonostante queste limitazioni, questa metodologia offre l’accesso a sistemi completamente nuovi che possono essere utilizzati come sonde biologiche o molecolari.
Introduction
Un certo numero di sistemi biciclici coniugati, in cui due anelli aromatici sono collegati da un ponte monometina, subiscono l’isomerizzazione tramite rotazione del legame, quando eccitati con un fotone(Figura 1A)1,2,3,4,5. L’isomero eccitato si rilasserà generalmente allo stato del suolo attraverso processi di decadimento nonradiativi 6. Se la barriera energetica alla rotazione del legame è aumentata in misura sufficiente, è possibile limitare o prevenire la fotoisomerizzazione. Invece, l’eccitazione fotonica si traduce in uno stato di singoletto eccitato che spesso si rilassa attraverso la fluorescenza piuttosto che il decadimento non radiativo (Figura 1B). La fotoisomerizzazione restrittiva è più comunemente realizzata limitando meccanicamente la rotazione del legame attraverso il collegamento dei due sistemi di anelli aromatici mediante collegamenti covalenti, bloccando così la molecola in un particolare stato isorico. Questo approccio è stato utilizzato per creare diversi analoghi fluorescenti triciclici dipirirolo e dipirolemetano come: 3H,5H-dipirrolo[1,2-c:2′,1′-f]pirimidina-3-uno (1), xanthoglows (2)6,7, analoghi pirroloindolizinedione (3)8e analoghi BODIPY 9 (4 , Figura 2) in base ai quali i sistemi ad anello di pirrolidina e/o pirrolole sono reticolati con metilene, carbonile, o linker difluoro al boro. Tipicamente, 1–4 possiedono ΦF > 0,7 suggerendo che questi sistemi sono molto efficienti come unità di fluoroforo.
È anche possibile limitare la fotoisomerizzazione attraverso mezzi diversi dal collegamento covalente dei sistemi ad anello. Ad esempio, gli anelli fenolici e imidazolinone (Figura 2) della proteina fluorescente verde (GFP) sono limitati alla rotazione da parte dell’ambiente proteico; l’impostazione restrittiva aumenta la resa quantica di tre ordini di grandezza rispetto alla stessa unità di cromoforo nella soluzione libera10. Si ritiene che l’impalcatura proteica della GFP fornisca una barriera rotazionale attraverso effetti sterici ed elettrostatici11. Recentemente, il nostro gruppo in collaborazione con il gruppo Odoh dell’Università del Nevada, Reno ha scoperto un altro sistema a fluoroforo che presenta una somiglianza strutturale con i sistemi xanthoglow a base di dipirrinone (Figura 2)12. Questi analoghi dipirrinone, tuttavia, differiscono dal sistema xanthoglow in quanto i legami idrogeno intramolecolari, piuttosto che legami covalenti, scoraggiano la fotoisomerizzazione e si traducono in un sistema biciclico fluorescente. Inoltre, gli analoghi pirazolo, imidazolo e isoindolone dipirrinone possono legare idrogeno in stati protonati e deprotonati; la deprotonazione si traduce nello spostamento verso il rosso delle lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione, probabilmente a causa di un cambiamento nella natura elettronica del sistema. Mentre è stato riferito che l’legame idrogeno aumenta le rese quantistiche attraverso una rotazione limitata13,14, 15,16, non siamo a conoscenza di nessun altro sistema di fluoroforo in cui l’isomerizzazione limitata serve come modalità di fluorescenza sia negli stati protonati che deprotonati della molecola. Pertanto, questi fluorofori di dipirrinone dipendenti dal pH sono unici in questo senso.
In questo video, ci concentriamo sulla sintesi e caratterizzazione chimica della serie analogica fluorescente dipyrrinone. In particolare, c’è un’enfasi posta sulla metodologia di condensazione claisen-schmidt che è stata utilizzata per costruire la serie completa di analoghi fluorescenti. Questa reazione si basa sulla generazione di uno ione enolato vinilegoo mediato in base che attacca un gruppo di aldeide, per produrre un alcol che successivamente subisce l’eliminazione. Per la serie analogica del dipirrinone, un pirrolinone/isoindolone viene convertito in un enolato per facilitare un attacco ad un gruppo di aldeidi attaccato ad un anello di pirazolo o imidazolo(Figura 3); dopo l’eliminazione si forma un sistema biciclico completamente coniugato, collegato da un ponte di metina. È degno di nota che l’intera serie di analoghi dipyrrinone possa essere costruita con materiali commerciali prontamente disponibili e possa essere prodotta in una singola sequenza di reazione a un vaso tipicamente in rese da moderate a alte (le rese vanno da circa il 50-95%). Poiché la maggior parte degli analoghi del dipirrinone sono di natura altamente cristallina, è necessaria pochissima purificazione al di fuori delle condizioni di lavoro standard per produrre campioni analiticamente puri. Di conseguenza, questo sistema a fluoroforo richiede solo pochi passaggi per accedere da materiali commerciali prontamente disponibili e può essere sintetizzato, purificato e preparato per studi analitici o biologici in un lasso di tempo relativamente breve.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approccio di condensazione di Claisen-Schmidt fornisce un mezzo abbastanza robusto per generare fluorofori di pirazolo, imidazolo e isoindolone dipirrinone attraverso un protocollo relativamente semplicistico dal punto di vista operativo. Mentre la sintesi degli analoghi fluorescenti del dipirrinone è stata al centro di questo studio, va notato che condizioni simili possono essere applicate per accedere ad altri sistemi ad anello biciclici collegati alla metina come i dipirrinoni23,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.R.W. e N.B. ringraziano il NIH (2P20 GM103440-14A1) per il loro generoso finanziamento, nonché Jungjae Koh e l’Università del Nevada, Las Vegas per la loro assistenza nell’acquisizione di NMR 1H e 13C. Inoltre, vorremmo ringraziare gli studenti dei media visivi NSC, Arnold Placencia-Flores, Aubry Jacobs e Alistair Cooper per il loro aiuto nei processi di riprese e animazione all’interno delle parti cinematografiche di questo manoscritto.
Materials
| 3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-one | Combi-Blocks | [766-36-9] | Yellow solid reagent |
| isoindolin-1-one | ArkPharm | [480-91-1] | Off-white solid reagent |
| 5-bromoisoindolin-1-one | Combi-Blocks | [552330-86-6] | Pink solid reagent |
| 2-formylimidazole | Combi-Blocks | [10111-08-7 ] | Off-white solid reagent |
| Imidazole-4-carbaldehyde | ArkPharm | [3034-50-2] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-4-carbaldehyde | Oakwood Chemicals | [35344-95-7] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-5-carbaldehyde | Matrix Scientific | [3920-50-1] | Solid reagent |
| Solid KOH Pellets | BeanTown Chemicals | [1310-58-3] | White solid pellets |
| Siliflash Silica Gel | Scilicycle | R12030B | Fine white powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (x10) | Growcells | MRGF-6235 | Colorless translucent liquid |
| Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrophotometer and Software | Beckman Coulter | N/A | Spectroscopy Instrument and Software |
| Fluoromax-4 Spectrofluorometer | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Instrument |
| FluorEssence Fluoremetry Software V3.5 | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Software |
| Finnpipette II Micropipette (sizes: 100-1,000, 20-200, and 0.5-10 µL) | Fischerbrand | N/A | Equipment |
| Wilmad-LabGlass Rotary Evaporator (Model: WG-EV311-V-PLUS) | SP Scienceware | N/A | Equipment |
| DuoSeal Vacuum Pump (Model Number: 1405) | Welch | N/A | Equipment |
| GraphPad Prism 4 | GraphPad | N/A | Data Analysis Software |
| SympHony pH Meter (Model: Sb70P) | VWR | N/A | Equipment |
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