JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Amostragem e processamento de escovação nasal usando videomicroscopia ciliar digital de alta velocidade – adaptação para a pandemia de COVID-19

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

Para garantir uma análise funcional ciliar bem-sucedida e de alta qualidade para o diagnóstico da DCP, um método preciso e cuidadoso para amostragem e processamento do epitélio respiratório é essencial. Para continuar prestando serviço de diagnóstico de PCD durante a pandemia de COVID-19, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi atualizado para incluir medidas adequadas de controle de infecção.

Abstract

A discinesia ciliar primária (DCP) é uma ciliopatia móvel genética, levando a doença otosinopulmonar significativa. O diagnóstico de DCP é frequentemente perdido ou atrasado devido a desafios com diferentes modalidades diagnósticas. A videomicroscopia ciliar, utilizando a Videomicroscopia Digital de Alta Velocidade (DHSV), uma das ferramentas diagnósticas para a DCP, é considerada o método ideal para a realização da análise funcional ciliar (AFC), compreendendo a análise da frequência dos batimentos ciliares (FSC) e do padrão dos batimentos (CBP). No entanto, o DHSV carece de procedimento operacional padronizado e publicado para processamento e análise de amostras. Ele também usa epitélio respiratório vivo, um problema significativo de controle de infecção durante a pandemia COVID-19. Para continuar prestando um serviço de diagnóstico durante esta crise sanitária, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi adaptado para incluir medidas adequadas de controle de infecção.

Aqui, descrevemos um protocolo revisado para amostragem e processamento laboratorial de amostras respiratórias ciliadas, destacando as adaptações feitas para cumprir as medidas de controle de infecção por COVID-19. Resultados representativos da AFC de amostras de escovação nasal obtidas de 16 indivíduos saudáveis, processados e analisados de acordo com este protocolo, são descritos. Também ilustramos a importância da obtenção e processamento de tiras epiteliais ciliadas de ótima qualidade, uma vez que amostras que não atendem aos critérios de seleção de qualidade permitem agora a AFC, potencialmente diminuindo a confiabilidade diagnóstica e a eficiência dessa técnica.

Introduction

A discinesia ciliar primária (DCP) é uma ciliopatia móvel heterogênea hereditária, na qual os cílios respiratórios são estacionários, lentos ou discinéticos, levando ao comprometimento do clearance mucociliar e doença oto-sino-pulmonar crônica1,2,3,4. As manifestações clínicas da DCP são tosse úmida crônica e congestão nasal crônica com início na primeira infância, infecções recorrentes ou crônicas do trato respiratório superior e inferior levando a bronquiectasias, otite média e sinusite recorrentes oucrônicas5,6,7. Aproximadamente metade dos pacientes com DCP apresenta defeitos de lateralidade de órgãos, como situs inversus ou situs ambiguus. Alguns pacientes também apresentam problemas de infertilidade devido à imobilidade de espermatozoides em homens e cílios imóveis nas tubas uterinas em mulheres 1,2,8. A DCP é rara, mas a prevalência é difícil de definir, variando de 1:10.000 a 1:20.000 9,10. No entanto, acredita-se que a prevalência real de DCP seja maior devido às dificuldades no diagnóstico e à falta de suspeita clínica. Os sintomas da DCP mimetizam manifestações respiratórias comuns de outras condições respiratórias agudas ou crônicas, e os desafios diagnósticos da confirmação diagnóstica são bem conhecidos, levando a tratamento e seguimento inadequados 2,5,9,11.

A videomicroscopia ciliar, utilizando Videomicroscopia Digital de Alta Velocidade (DHSV), é uma das ferramentas diagnósticas para a DCP4,8,12,13. O DHSV é considerado o método ideal para a realização da análise funcional ciliar (AFC), compreendendo a análise da frequência dos batimentos ciliares (FSC) e do padrão dos batimentos (CBP)2,14,15,16. O DHSV utiliza epitélio respiratório vivo, geralmente obtido a partir de escovaçãonasal13.

Em vista do surto COVID-19 atual, a confirmação de um diagnóstico de PCD é agora ainda mais importante, pois as evidências sugerem que a doença respiratória subjacente pode levar a piores resultados após a infecção por COVID-1917,18. Um serviço de diagnóstico de PCD seguro e eficiente durante a pandemia atual também permitirá que pacientes confirmados com PCD se beneficiem de medidas de proteção adicionais, em comparação com a população em geral19.

A transmissão da COVID-19 ocorre principalmente através da disseminação de gotículas20. O alto potencial de transmissão a partir de pacientes assintomáticos (ou minimamente sintomáticos) é sugerido pela alta carga viral em amostranasal20. Além disso, se as partículas virais se tornarem aerossolizadas, elas permanecerão no ar por pelo menos 3 horas21. Portanto, os profissionais de saúde respiratória são expostos a um alto reservatório de carga viral durante a realização de cuidados clínicos e coleta de amostras para técnicasdiagnósticas22. Além disso, a manipulação de amostras respiratórias vivas expõe o técnico à contaminação por COVID-19. Enquanto as recomendações de melhores práticas para médicos respiratórios e cirurgiões otorrinolaringologistas que cuidam de pacientes COVID-19 estão sendo implementadas23, há uma falta de recomendações para a realização de DHSV durante a pandemia COVID-19.

Para continuar prestando um serviço de diagnóstico PCD, garantindo a segurança do profissional de saúde (realizando a coleta de amostras) e do técnico (realizando o processamento de amostras), o protocolo de videomicroscopia ciliar teve que ser adaptado durante a pandemia da COVID-19. A técnica de videomicroscopia ciliar atualmente é limitada a serviços de pesquisa e centros de diagnóstico especializados, uma vez que a AFC requer amplo treinamento e experiência. Além disso, atualmente, há uma falta de padronização e procedimento operacional preciso para o processamento e análise de amostras utilizando DHSV 4,13.

O objetivo deste trabalho é descrever os procedimentos operacionais padrão para DHSV, com particular referência às medidas de controle de infecção e segurança na amostragem e processamento do epitélio nasal vivo. Isso permitirá que o diagnóstico e o cuidado de PCD de alta qualidade continuem, apesar do atual surto de COVID-19.

Protocol

A aprovação foi obtida do comitê de ética do hospital-faculdade de Liège e do Departamento de Higiene e Proteção à Saúde no Trabalho da Universidade. 1. Amostragem do epitélio respiratório ciliado Certifique-se de que os indivíduos estejam livres de infecção por pelo menos 4-6 semanas, e livres de medicação nasal e inalatória, antes da amostragem. Preparar preparação M199 suplementada: Suplemento Meio de Cultura Celular 199 (M199) (500 mL) com solução a…

Representative Results

Para ilustrar a eficiência da técnica, apresentamos os resultados da AFC em uma série de 16 voluntários adultos saudáveis (5 homens, faixa etária de 22-54 anos). Amostras de escovação nasal de 14 (4 homens, faixa etária de 24-54 anos) do total de 16 voluntários forneceram bordas epiteliais adequadas suficientes que satisfizeram os critérios de seleção necessários para a realização da AFC. Destas 14 amostras de escovação nasal, um total de 242 bordas ciliadas foram registradas…

Discussion

Este artigo visa fornecer um procedimento operacional padrão para CFA usando amostras de escovação nasal, com ajustes feitos para considerações apropriadas de controle de infecção durante a pandemia COVID-19. O diagnóstico da DCP é desafiador e, atualmente, requer um painel de diferentes testes diagnósticos, de acordo com a recomendação internacional, incluindo dosagem nasal de óxido nítrico, CFA por DHSV, análise ultraestrutural ciliar por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), marcação de prote…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier e a todos os membros da equipe do centro de diagnóstico PCD de Paris-Est por sua disponibilidade e calorosa recepção durante a visita ao seu centro de diagnóstico PCD, e os inúmeros intercâmbios. Também agradecemos a Robert Hirst e a todos os membros da equipe do centro PCD de Leicester por sua recepção e tempo, conselhos e experiência.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer
check_url/it/61949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image