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Abstract
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Immunologia e infezioni

デジタル高速毛様体ビデオ顕微鏡を使用した鼻ブラッシングサンプリングと処理–COVID-19パンデミックへの適応

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

PCD診断のための高品質毛様体機能解析を成功させるには、呼吸上皮のサンプリングと処理のための正確で慎重な方法が不可欠です。COVID-19パンデミックの間もPCD診断サービスを提供し続けるために、毛様体ビデオ顕微鏡プロトコルが更新され、適切な感染管理対策が追加されました。

Abstract

原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、遺伝的運動性繊毛症であり、重大な耳鼻咽喉科肺疾患を引き起こします。PCD診断は、さまざまな診断モダリティの課題のために見逃されたり遅れたりすることがよくあります。PCDの診断ツールの一つであるデジタル高速ビデオ顕微鏡(DHSV)を用いた毛様体ビデオ顕微鏡は、毛様体拍動周波数(CBF)と拍動パターン(CBP)解析からなる毛様体機能解析(CFA)を行うのに最適な方法と考えられています。ただし、DHSVには、サンプルを処理および分析するための標準化された公開された操作手順がありません。また、COVID-19パンデミック時の重大な感染管理の問題である生体呼吸器上皮を使用しています。この健康危機の間も診断サービスを提供し続けるために、毛様体ビデオ顕微鏡プロトコルは、適切な感染管理対策を含むように適応されています。

ここでは、繊毛呼吸器サンプルのサンプリングと実験室処理のための改訂されたプロトコルについて説明し、COVID-19感染管理対策に準拠するために行われた適応を強調します。このプロトコルに従って処理および分析された、16人の健康な被験者から得られた鼻ブラッシングサンプルからのCFAの代表的な結果が記載されている。また、品質選択基準を満たさないサンプルではCFAが可能になり、診断の信頼性とこの技術の効率が低下する可能性があるため、最適な品質の上皮繊毛ストリップを取得して処理することの重要性についても説明します。

Introduction

原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、遺伝性の不均一な運動性繊毛症であり、呼吸繊毛が静止している、遅い、または運動障害であり、粘液繊毛クリアランスの障害および慢性耳鼻肺疾患を引き起こします1,2,3,4。PCDの臨床症状は、乳児期初期から始まる慢性的な湿った咳と慢性的な鼻づまり、気管支拡張症につながる再発性または慢性の上気道および下気道感染症、および再発性または慢性の中耳炎と副鼻腔炎です5,6,7。PCD患者の約半数は、上皮内または曖昧な上皮などの臓器側性欠損を呈しています。一部の患者はまた、男性の不動の精子と女性の卵管の不動繊毛による不妊症の問題を呈します1,2,8。PCDはまれですが、有病率を定義するのは難しく、1:10,000から1:20,000の範囲です9,10。しかし、PCDの実際の有病率は、診断の難しさと臨床的疑いの欠如のためにより高いと考えられています。PCDの症状は、他の急性または慢性呼吸器疾患の一般的な呼吸器症状を模倣しており、診断を確認することの診断上の課題はよく知られており、不十分な治療とフォローアップにつながります2,5,9,11。

デジタル高速ビデオ顕微鏡(DHSV)を使用した毛様体ビデオ顕微鏡は、PCD4、8、12、13の診断ツールの1つです。DHSVは、毛様体拍動周波数(CBF)および拍動パターン(CBP)分析からなる毛様体機能分析(CFA)を実行するための最適な方法と考えられている2,14,15,16。DHSVは、通常、鼻ブラッシングから得られる生きている呼吸上皮を使用する13。

現在のCOVID-19の発生を考慮すると、基礎となる呼吸器疾患がCOVID-19感染後の転帰の悪化につながる可能性があることを証拠が示唆しているため、PCD診断の確認はさらに重要になっています17,18。現在のパンデミック時の安全で効率的なPCD診断サービスにより、確認されたPCD患者は、一般の人々と比較して、追加の保護措置の恩恵を受けることができます19。

COVID-19の感染は、主に飛沫拡散20を介して発生します。無症候性(または最小限の症候性)患者からの感染の高い可能性は、鼻サンプル20の高いウイルス量によって示唆される。さらに、ウイルス粒子がエアロゾル化されると、少なくとも3時間空気中にとどまります21。したがって、呼吸器医療従事者は、診断技術22のための臨床ケアおよびサンプル収集を行っている間、ウイルス量の高い貯蔵庫にさらされる。さらに、生きている呼吸器サンプルの操作は、技術者をCOVID-19汚染にさらします。COVID-19患者の世話をする呼吸器内科医と耳鼻咽喉科外科医のためのベストプラクティスの推奨事項が実施されていますが23、COVID-19パンデミック時にDHSVを実行するための推奨事項は不足しています。

PCD診断サービスを提供し続けるために、医療従事者(サンプル収集の実行)と技術者(サンプル処理の実行)の安全を確保しながら、毛様体ビデオ顕微鏡プロトコルをCOVID-19パンデミックに適応させる必要がありました。毛様体ビデオ顕微鏡の技術は、CFAが広範なトレーニングと経験を必要とするため、現在、研究サービスと専門の診断センターに限定されています。さらに、現在、DHSV 4,13を使用してサンプルを処理および分析するための標準化と正確な操作手順が不足しています。

この論文の目的は、DHSVの標準的な操作手順、特に生体鼻上皮をサンプリングおよび処理する際の感染対策と安全性を参照して説明することです。これにより、現在のCOVID-19の発生にもかかわらず、高品質のPCD診断とケアを継続することができます。

Protocol

承認は、リエージュの病院と教員の倫理委員会と職場の衛生と健康保護のための大学部門から得られました。 1.呼吸繊毛上皮のサンプリング サンプリングする前に、被験者が少なくとも4〜6週間感染がなく、鼻薬や吸入薬がないことを確認してください。 補充されたM199製剤を調製する:細胞培養培地199(M199)(500 mL)に抗生物質溶液(5 mLのストレプトマイシン/?…

Representative Results

この技術の効率を説明するために、16人の健康な成人ボランティア(男性5人、年齢層22〜54歳)のシリーズでCFAの結果を紹介します。 合計16人のボランティアのうち14人(男性4人、年齢範囲24〜54歳)の鼻ブラッシングサンプルは、CFAを実行するために必要な選択基準を満たすのに十分な適切な上皮エッジを提供しました。これらの14の鼻ブラッシングサンプルから、合計242の繊?…

Discussion

この論文は、鼻ブラッシングサンプルを使用したCFAの標準的な操作手順を提供することを目的としており、COVID-19パンデミック時の適切な感染管理の考慮事項に合わせて調整が行われます。PCD診断は困難であり、現在、鼻一酸化窒素測定、DHSVを使用したCFA、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用した毛様体超微細構造分析、免疫蛍光を使用した毛様体タンパク質の標識、PCD原因遺伝子の遺伝子検査な?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ジャン・フランソワ・パポン、ブルーノ・ルイ、エステル・エスクディエ、そしてパリ東のPCD診断センターのすべてのチームメンバーが、PCD診断センターへの訪問中に彼らの可用性と心からの歓迎、および多数の交換に感謝します。また、ロバート・ハーストとレスターのPCDセンターのすべてのチームメンバーの歓迎と時間、アドバイス、専門知識に感謝します。

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

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Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
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