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Immunologia e infezioni

디지털 고속 섬모 비디오 현미경을 사용한 비강 칫솔질 샘플링 및 처리 – COVID-19 전염병에 대한 적응

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

PCD 진단을 위한 성공적이고 고품질의 섬모 기능 분석을 보장하려면 호흡기 상피 샘플링 및 처리를 위한 정확하고 신중한 방법이 필수적입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 PCD 진단 서비스를 계속 제공하기 위해 섬모 비디오 현미경 프로토콜이 적절한 감염 관리 조치를 포함하도록 업데이트되었습니다.

Abstract

원발성 섬모 운동이상증(PCD)은 유전적 운동성 섬모병증으로 심각한 이인후성 질환을 유발합니다. PCD 진단은 다양한 진단 양식의 문제로 인해 종종 놓치거나 지연됩니다. PCD의 진단 도구 중 하나인 디지털 고속 비디오현미경(DHSV)을 사용하는 섬모 비디오현미경은 섬모 박동 주파수(CBF) 및 박동 패턴(CBP) 분석으로 구성된 섬모 기능 분석(CFA)을 수행하는 최적의 방법으로 간주됩니다. 그러나 DHSV에는 샘플 처리 및 분석을 위한 표준화되고 공개된 운영 절차가 없습니다. 또한 COVID-19 대유행 기간 동안 중요한 감염 통제 문제인 살아있는 호흡기 상피를 사용합니다. 이 건강 위기 동안 진단 서비스를 계속 제공하기 위해 섬모 비디오 현미경 프로토콜은 적절한 감염 관리 조치를 포함하도록 조정되었습니다.

여기에서는 섬모 호흡기 샘플의 샘플링 및 실험실 처리를 위한 수정된 프로토콜을 설명하고 COVID-19 감염 관리 조치를 준수하기 위한 조정을 강조합니다. 이 프로토콜에 따라 처리 및 분석된 16명의 건강한 피험자로부터 얻은 비강 칫솔질 샘플에서 CFA의 대표적인 결과가 설명됩니다. 또한 품질 선택 기준을 충족하지 않는 샘플이 이제 CFA를 허용하여 잠재적으로 이 기술의 진단 신뢰성과 효율성을 감소시키기 때문에 최적의 품질의 상피 섬모 스트립을 얻고 처리하는 것의 중요성을 설명합니다.

Introduction

원발성 섬모 운동이상증(PCD)은 유전성 이질성 운동성 섬모병증으로, 호흡 섬모가 고정되어 있거나 느리거나 이상운동성이어서 점액섬모 청소율 장애 및 만성 이-중국-폐질환을 유발합니다 1,2,3,4. PCD의 임상 증상은 유아기 초기에 시작되는 만성 습기침 및 만성 코막힘, 기관지확장증을 유발하는 재발성 또는 만성 상기도 및 하부 호흡기 감염, 재발성 또는 만성 중이염 및 부비동염이다 5,6,7. PCD 환자의 약 절반이 좌측 또는 모호성 좌절과 같은 장기 편측성 결함을 나타냅니다. 일부 환자는 또한 남성의 고정성 정자와 여성의 나팔관의 고정성 섬모로 인한 불임 문제를 나타냅니다 1,2,8. PCD는 드물지만 유병률은 정의하기 어렵고 범위는 1:10,000에서 1:20,000 9,10입니다. 그러나 PCD의 실제 유병률은 진단의 어려움과 임상적 의심의 부족으로 인해 더 높은 것으로 생각됩니다. PCD의 증상은 다른 급성 또는 만성 호흡기 질환의 일반적인 호흡기 증상을 모방하며, 진단을 확인하는 진단적 어려움은 잘 알려져 있어 부적절한 치료 및 추적 관찰로 이어진다 2,5,9,11.

디지털 고속 비디오현미경(DHSV)을 사용하는 섬모 비디오현미경은 PCD 4,8,12,13의 진단 도구 중 하나입니다. DHSV는 섬모 박동 빈도(CBF) 및 박동 패턴(CBP) 분석 2,14,15,16을 포함하는 섬모 기능 분석(CFA)을 수행하는 최적의 방법으로 간주됩니다. DHSV는 일반적으로 비강 칫솔질에서 얻은 살아있는 호흡기 상피를 사용한다13.

현재 COVID-19 발생을 고려할 때, 근본적인 호흡기 질환이 COVID-19 감염 후 더 나쁜 결과를 초래할 수 있다는 증거가 있기 때문에 PCD 진단의 확인이 더욱 중요합니다17,18. 현재 팬데믹 기간 동안 안전하고 효율적인 PCD 진단 서비스를 통해 확인된 PCD 환자는 일반 인구에 비해 추가 보호 조치의 혜택을 받을 수 있습니다19.

COVID-19의 전파는 주로 비말 확산을 통해 발생한다20. 무증상(또는 최소 증상) 환자로부터의 높은 전염 가능성은 코 샘플(20)의 높은 바이러스 부하에 의해 시사된다. 또한 바이러스 입자가 에어로졸화되면 최소 3시간 동안 공기 중에 머무른다21. 그러므로, 호흡기 건강 관리 종사자들은 진단 기술(22)을 위한 임상 치료 및 샘플 수집을 수행하는 동안 높은 바이러스 부하의 저장고에 노출된다. 또한 살아있는 호흡기 샘플을 조작하면 기술자가 COVID-19 오염에 노출됩니다. COVID-19 환자를 돌보는 호흡기 전문의와 이비인후과 의사를 위한 모범 사례 권장 사항이 시행되고 있지만23, COVID-19 팬데믹 기간 동안 DHSV를 수행하기 위한 권장 사항이 부족합니다.

PCD 진단 서비스를 계속 제공하면서 의료 종사자(검체 채취 수행)와 기술자(검체 처리 수행)의 안전을 보장하기 위해 COVID-19 팬데믹 기간 동안 섬모 비디오 현미경 프로토콜을 조정해야 했습니다. 섬모 비디오 현미경 기술은 현재 CFA가 광범위한 교육과 경험을 필요로하기 때문에 연구 서비스 및 전문 진단 센터로 제한됩니다. 또한, 현재 DHSV 4,13을 사용하여 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준화 및 정확한 운영 절차가 부족합니다.

이 논문의 목적은 특히 살아있는 비강 상피를 샘플링하고 처리할 때 감염 관리 조치 및 안전성과 관련하여 DHSV에 대한 표준 운영 절차를 설명하는 것입니다. 이를 통해 현재 COVID-19 발생에도 불구하고 고품질 PCD 진단 및 치료를 계속할 수 있습니다.

Protocol

리에주 병원-교수 윤리 위원회와 직장 위생 및 건강 보호를 위한 대학 부서의 승인을 받았습니다. 1. 호흡기 섬모 상피 샘플링 샘플링 전에 피험자가 최소 4-6주 동안 감염되지 않았는지, 비강 및 흡입 약물이 없는지 확인하십시오. 보충된 M199 제제 준비: 항생제 용액(스트렙토마이신/페니실린 5mL(50μg/mL)) 및 항진균액(암포테리신 B 5mL(2.5μg/mL))으로 보충 세포 배양 …

Representative Results

이 기술의 효율성을 설명하기 위해 일련의 16명의 건강한 성인 지원자(남성 5명, 연령 범위 22-54세)에서 CFA의 결과를 제시합니다. 총 16명의 지원자 중 14명(남성 4명, 연령대 24-54세)의 비강 칫솔질 샘플은 CFA를 수행하는 데 필요한 선택 기준을 충족하는 적절한 상피 가장자리를 충분히 제공했습니다. 이 14개의 비강 칫솔질 샘플에서 총 242개의 섬모 가장자리가 기록되었고 212개의…

Discussion

이 문서는 COVID-19 대유행 기간 동안 적절한 감염 관리 고려 사항을 조정하여 비강 칫솔질 샘플을 사용하는 CFA에 대한 표준 운영 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다. PCD 진단은 도전적이며 현재 비강 산화질소 측정, DHSV를 사용한 CFA, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한 섬모 미세 구조 분석, 면역형광을 사용한 섬모 단백질 표지, PCD 유발 유전자에 대한 유전자 검사 등 국제 권고에 따라 다양한 진단 테…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier 및 Paris-Est PCD 진단 센터의 모든 팀원들이 PCD 진단 센터를 방문하는 동안 가용성과 진심 어린 환영을 받고 수많은 교류에 감사드립니다. 또한 로버트 허스트 (Robert Hirst)와 레스터 PCD 센터의 모든 팀원들의 환영과 시간, 조언 및 전문 지식에 감사드립니다.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

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Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
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