JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Næsebørstning, prøveudtagning og behandling ved hjælp af digital højhastigheds ciliær videomikroskopi - tilpasning til COVID-19-pandemien

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

For at garantere en vellykket ciliær funktionel analyse af høj kvalitet til PCD-diagnose er en præcis og omhyggelig metode til prøveudtagning og behandling af åndedrætsepitel afgørende. For fortsat at kunne levere PCD-diagnosticeringstjeneste under COVID-19-pandemien er den ciliære videomikroskopiprotokol blevet opdateret til at omfatte passende infektionskontrolforanstaltninger.

Abstract

Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en genetisk bevægelig ciliopati, der fører til signifikant otosinopulmonal sygdom. PCD-diagnose overses ofte eller forsinkes på grund af udfordringer med forskellige diagnostiske modaliteter. Ciliær videomikroskopi ved hjælp af Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), et af de diagnostiske værktøjer til PCD, betragtes som den optimale metode til at udføre ciliær funktionel analyse (CFA), der består af ciliary beat frequency (CBF) og beat pattern (CBP) analyse. DHSV mangler imidlertid standardiseret, offentliggjort driftsprocedure til behandling og analyse af prøver. Det bruger også levende respiratorisk epitel, et betydeligt infektionskontrolproblem under COVID-19-pandemien. For fortsat at yde en diagnostisk service under denne sundhedskrise er ciliary videomikroskopi-protokollen blevet tilpasset til at omfatte passende infektionskontrolforanstaltninger.

Her beskriver vi en revideret protokol for prøveudtagning og laboratoriebehandling af cilierede åndedrætsprøver, der fremhæver tilpasninger foretaget for at overholde COVID-19-infektionskontrolforanstaltninger. Repræsentative resultater af CFA fra næsebørstningsprøver opnået fra 16 raske forsøgspersoner, behandlet og analyseret i henhold til denne protokol, er beskrevet. Vi illustrerer også vigtigheden af at opnå og behandle epitelcilierede strimler af optimal kvalitet, da prøver, der ikke opfylder kvalitetsudvælgelseskriterierne, nu giver mulighed for CFA, hvilket potentielt reducerer den diagnostiske pålidelighed og effektiviteten af denne teknik.

Introduction

Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en arvelig heterogen bevægelig ciliopati, hvor respiratoriske cilier er stationære, langsomme eller dyskinetiske, hvilket fører til nedsat mucociliær clearance og kronisk oto-sino-lungesygdom 1,2,3,4. De kliniske manifestationer af PCD er kronisk våd hoste og kronisk tilstoppet næse, der starter i tidlig barndom, tilbagevendende eller kroniske øvre og nedre luftvejsinfektioner, der fører til bronchiectasis og tilbagevendende eller kronisk otitis media og bihulebetændelse 5,6,7. Ca. halvdelen af PCD-patienter har organlateralitetsdefekter såsom situs inversus eller situs ambiguus. Nogle patienter har også problemer med infertilitet på grund af immotile sædceller hos mænd og immotile cilier i æggelederne hos kvinder 1,2,8. PCD er sjælden, men forekomsten er vanskelig at definere og varierer fra 1:10.000 til 1:20.000 9,10. Den reelle forekomst af PCD menes imidlertid at være højere på grund af vanskeligheder med diagnosticering og manglende klinisk mistanke. Symptomer på PCD efterligner almindelige respiratoriske manifestationer af andre akutte eller kroniske luftvejssygdomme, og de diagnostiske udfordringer ved at bekræfte diagnosen er velkendte, hvilket fører til utilstrækkelig behandling og opfølgning 2,5,9,11.

Ciliær videomikroskopi, ved hjælp af Digital High-Speed Videomikroskopi (DHSV), er et af de diagnostiske værktøjer til PCD 4,8,12,13. DHSV betragtes som den optimale metode til at udføre ciliær funktionel analyse (CFA), der består af ciliary beat frequency (CBF) og beat pattern (CBP) analyse 2,14,15,16. DHSV bruger levende respiratorisk epitel, normalt opnået ved nasal børstning13.

I lyset af det nuværende COVID-19-udbrud er bekræftelse af en PCD-diagnose nu endnu vigtigere, da beviser tyder på, at underliggende luftvejssygdomme kan føre til dårligere resultater efter COVID-19-infektion17,18. En sikker og effektiv diagnosticeringstjeneste for udviklingsvenlig politikkohærens under den nuværende pandemi vil også gøre det muligt for bekræftede patienter med udviklingsvenlig politikkohærens at drage fordel af yderligere beskyttelsesforanstaltninger sammenlignet med befolkningen som helhed19.

Overførsel af COVID-19 sker primært gennem dråbespredning20. Højt potentiale for transmission fra asymptomatiske (eller minimalt symptomatiske) patienter antydes af den høje virale belastning i næseprøve20. Derudover, hvis virale partikler bliver aerosoliseret, forbliver de i luften i mindst 3 timer21. Derfor udsættes respiratorisk sundhedspersonale for et højt reservoir af viral belastning, mens de udfører klinisk pleje og prøveindsamling til diagnostiske teknikker22. Desuden udsætter manipulation af levende åndedrætsprøver teknikeren for COVID-19-kontaminering. Mens anbefalinger om bedste praksis for respiratoriske læger og ØNH-kirurger, der plejer COVID-19-patienter, implementeres23, mangler der anbefalinger til udførelse af DHSV under COVID-19-pandemien.

For fortsat at kunne levere en udviklingsvenlig udviklingsdiagnostisk tjeneste og samtidig garantere sundhedsarbejderens sikkerhed (udføre prøveindsamling) og tekniker (udføre prøvebehandling) måtte ciliær videomikroskopiprotokollen tilpasses under covid-19-pandemien. Teknikken til ciliær videomikroskopi er i øjeblikket begrænset til forskningsservice og specialiserede diagnostiske centre, da CFA kræver omfattende træning og erfaring. Desuden mangler der i øjeblikket standardisering og præcis driftsprocedure til behandling og analyse af prøver ved hjælp af DHSV 4,13.

Formålet med dette papir er at beskrive standardprocedurer for DHSV med særlig henvisning til infektionskontrolforanstaltninger og sikkerhed ved prøveudtagning og behandling af levende næseepitel. Dette vil gøre det muligt at fortsætte diagnosticering og pleje af udviklingsvenlig politikkohærens af høj kvalitet på trods af det nuværende covid-19-udbrud.

Protocol

Der blev opnået godkendelse fra Liège hospital-fakultetets etiske udvalg og universitetets afdeling for hygiejne og sundhedsbeskyttelse på arbejdspladsen. 1. Prøveudtagning af respiratorisk cilieret epitel Sørg for, at forsøgspersonerne er fri for infektion i mindst 4-6 uger og fri for nasal og inhaleret medicin, før prøveudtagning. Forbered suppleret M199-præparat: Supplement Cell Culture Medium 199 (M199) (500 ml) med antibiotikaopløsning (5 ml streptomycin / pe…

Representative Results

For at illustrere effektiviteten af teknikken præsenterer vi resultaterne af CFA i en serie på 16 raske voksne frivillige (5 mænd, aldersgruppe 22-54 år). Næsebørstningsprøver fra 14 (4 mænd, aldersgruppe 24-54 år) ud af de i alt 16 frivillige gav nok passende epitelkanter, der opfyldte udvælgelseskriterierne for at udføre CFA. Fra disse 14 næsebørstningsprøver blev der registreret i alt 242 cilierede kanter, og 212 kanter opfyldte de definerede inklusionskriterier og blev analys…

Discussion

Dette papir har til formål at tilvejebringe en standardprocedure for CFA ved hjælp af næsebørstningsprøver med justeringer foretaget for passende infektionskontrolovervejelser under COVID-19-pandemien. PCD-diagnose er udfordrende og kræver i øjeblikket et panel af forskellige diagnostiske tests i henhold til international anbefaling, herunder nasal nitrogenoxidmåling, CFA ved hjælp af DHSV, ciliær ultrastrukturel analyse ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), mærkning af ciliære proteiner ved hj…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier og alle teammedlemmer af PCD-diagnostisk center i Paris-Est for deres tilgængelighed og hjertelig velkomst under besøget på deres PCD-diagnostiske center og de mange udvekslinger. Vi takker også Robert Hirst og alle teammedlemmer på PCD-centret i Leicester for deres velkomst og tid, råd og ekspertise.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer
check_url/it/61949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image