JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Nasal børsting prøvetaking og prosessering ved hjelp av digital høyhastighets ciliary videomikroskopi - tilpasning for COVID-19-pandemien

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

For å garantere en vellykket og høy kvalitet ciliær funksjonsanalyse for PCD-diagnose, er en presis og forsiktig metode for prøvetaking og behandling av respiratorisk epitel avgjørende. For å fortsette å tilby PCD-diagnostisk tjeneste under COVID-19-pandemien, har ciliary videomicroscopy-protokollen blitt oppdatert for å inkludere passende infeksjonskontrolltiltak.

Abstract

Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en genetisk bevegelig ciliopati, som fører til betydelig otosinopulmonal sykdom. PCD-diagnose blir ofte oversett eller forsinket på grunn av utfordringer med ulike diagnostiske modaliteter. Ciliær videomikroskopi, ved hjelp av Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), et av de diagnostiske verktøyene for PCD, regnes som den optimale metoden for å utføre ciliær funksjonell analyse (CFA), bestående av ciliær beatfrekvens (CBF) og beatmønster (CBP) analyse. DHSV mangler imidlertid standardisert, publisert operasjonsprosedyre for behandling og analyse av prøver. Den bruker også levende luftveisepitel, et betydelig infeksjonskontrollproblem under COVID-19-pandemien. For å fortsette å tilby en diagnostisk tjeneste under denne helsekrisen, har den ciliære videomikroskopiprotokollen blitt tilpasset for å inkludere tilstrekkelige infeksjonskontrolltiltak.

Her beskriver vi en revidert protokoll for prøvetaking og laboratoriebehandling av cilierte luftveisprøver, som fremhever tilpasninger som er gjort for å overholde smitteverntiltakene mot covid-19. Representative resultater av CFA fra nesebørsteprøver oppnådd fra 16 friske personer, behandlet og analysert i henhold til denne protokollen, er beskrevet. Vi illustrerer også viktigheten av å skaffe og behandle epiteliale cilierte strimler av optimal kvalitet, da prøver som ikke oppfyller kvalitetsvalgskriterier, nå tillater CFA, noe som potensielt reduserer den diagnostiske påliteligheten og effektiviteten til denne teknikken.

Introduction

Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en arvelig heterogen bevegelig ciliopati, der respiratoriske cilier er stasjonære, langsomme eller dyskinetiske, noe som fører til nedsatt mukociliær clearance og kronisk oto-sino-lungesykdom 1,2,3,4. De kliniske manifestasjonene av PCD er kronisk våt hoste og kronisk nesetetthet som starter i tidlig barndom, tilbakevendende eller kroniske øvre og nedre luftveisinfeksjoner som fører til bronkiektasier, og tilbakevendende eller kronisk otitis media og bihulebetennelse 5,6,7. Omtrent halvparten av PCD-pasientene har organlateralitetsdefekter som situs inversus eller situs ambiguus. Noen pasienter presenterer også infertilitetsproblemer på grunn av immotile sædceller hos menn og immotile cilia i egglederne hos kvinner 1,2,8. PCD er sjelden, men forekomsten er vanskelig å definere, og varierer fra 1:10 000 til 1:20 000 9,10. Den reelle forekomsten av PCD antas imidlertid å være høyere på grunn av vanskeligheter med diagnostisering og manglende klinisk mistanke. Symptomer på PCD etterligner vanlige respiratoriske manifestasjoner ved andre akutte eller kroniske luftveislidelser, og de diagnostiske utfordringene ved å bekrefte diagnosen er velkjente, noe som fører til mangelfull behandling og oppfølging 2,5,9,11.

Ciliær videomikroskopi, ved hjelp av Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), er et av diagnoseverktøyene for PCD 4,8,12,13. DHSV regnes som den optimale metoden for å utføre ciliær funksjonsanalyse (CFA), bestående av ciliary beat frequency (CBF) og beat pattern (CBP) analyse 2,14,15,16. DHSV bruker levende respiratorisk epitel, vanligvis hentet fra nesebørsting13.

I lys av det nåværende COVID-19-utbruddet er bekreftelse av en PCD-diagnose nå enda viktigere ettersom bevis tyder på at underliggende luftveissykdom kan føre til verre utfall etter COVID-19-infeksjon17,18. En trygg og effektiv PCD-diagnostisk tjeneste under den nåværende pandemien vil også gi bekreftede PCD-pasienter mulighet til å dra nytte av ytterligere beskyttelsestiltak, sammenlignet med befolkningengenerelt 19.

Overføring av covid-19 skjer primært gjennom dråpespredning20. Høyt overføringspotensial fra asymptomatiske (eller minimalt symptomatiske) pasienter antydes av den høye virusbelastningen i neseprøve20. I tillegg, hvis viruspartikler blir aerosoliserte, forblir de i luften i minst 3 timer21. Derfor blir respiratoriske helsepersonell utsatt for et høyt reservoar av virusbelastning mens de utfører klinisk behandling og prøveinnsamling for diagnostiske teknikker22. Videre utsetter manipulering av levende luftveisprøver teknikeren for COVID-19-forurensning. Mens anbefalinger for beste praksis for respiratoriske leger og ØNH-kirurger som tar vare på COVID-19-pasienter blir implementert23, mangler det anbefalinger for å utføre DHSV under COVID-19-pandemien.

For å kunne fortsette å tilby en PCD-diagnostisk tjeneste, samtidig som sikkerheten til helsearbeideren (utfører prøveinnsamling) og tekniker (utfører prøvebehandling), måtte ciliary videomicroscopy-protokollen tilpasses under COVID-19-pandemien. Teknikken for ciliary videomikroskopi er for tiden begrenset til forskningstjeneste og spesialiserte diagnostiske sentre, da CFA krever omfattende opplæring og erfaring. Videre er det for tiden mangel på standardisering og presis driftsprosedyre for behandling og analyse av prøver ved bruk av DHSV 4,13.

Målet med denne artikkelen er å beskrive standard driftsprosedyrer for DHSV, med særlig henvisning til smitteverntiltak og sikkerhet ved prøvetaking og prosessering av levende neseepitel. Dette vil gjøre det mulig for PCD-diagnose og omsorg av høy kvalitet å fortsette, til tross for det nåværende COVID-19-utbruddet.

Protocol

Godkjenning ble innhentet fra Liège sykehus-fakultetets etiske komité og Universitetsavdelingen for hygiene og helsevern på arbeidsplassen. 1. Prøvetaking av respiratorisk ciliert epitel Sørg for at forsøkspersonene er infeksjonsfrie i minst 4-6 uker, og fri for nasal og inhalert medisinering, før prøvetaking. Forbered supplert M199-preparat: Supplement Cell Culture Medium 199 (M199) (500 ml) med antibiotikaoppløsning (5 ml streptomycin / penicillin (50 μg / ml)) …

Representative Results

For å illustrere effektiviteten av teknikken, presenterer vi resultatene av CFA i en serie på 16 friske voksne frivillige (5 menn, aldersgruppe 22-54 år). Nesebørsteprøver fra 14 (4 menn, aldersgruppe 24-54 år) av totalt 16 frivillige ga nok passende epitelkanter som tilfredsstilte utvalgskriteriene som trengs for å utføre CFA. Fra disse 14 nesebørsteprøvene ble totalt 242 cilierte kanter registrert, og 212 kanter oppfylte de definerte inklusjonskriteriene og ble analysert. Alle diss…

Discussion

Denne rapporten tar sikte på å gi en standard operasjonsprosedyre for CFA ved bruk av nesebørsteprøver, med justeringer gjort for passende infeksjonskontrollhensyn under COVID-19-pandemien. PCD-diagnose er utfordrende, og krever i dag et panel av ulike diagnostiske tester, i henhold til internasjonale anbefalinger, inkludert nasal nitrogenoksidmåling, CFA ved bruk av DHSV, ciliær ultrastrukturell analyse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), merking av ciliærproteiner ved bruk av immunfluorescens og g…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier og alle teammedlemmer av PCD diagnostiske senter i Paris-Est for deres tilgjengelighet og hjertelig velkomst under besøket til deres PCD-diagnostiske senter, og de mange utvekslingene. Vi takker også Robert Hirst og alle teammedlemmer ved PCD-senteret i Leicester for deres velkomst og tid, råd og ekspertise.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer
check_url/it/61949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image