JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Nasal borstning provtagning och bearbetning med digital höghastighets ciliär videomikroskopi - Anpassning för COVID-19-pandemin

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

För att garantera en framgångsrik och högkvalitativ ciliär funktionell analys för PCD-diagnos är en exakt och noggrann metod för provtagning och bearbetning av andningsepitel avgörande. För att fortsätta tillhandahålla PCD-diagnostiktjänster under COVID-19-pandemin har protokollet för ciliär videomikroskopi uppdaterats för att inkludera lämpliga infektionskontrollåtgärder.

Abstract

Primär ciliär dyskinesi (PCD) är en genetisk rörlig ciliopati, vilket leder till signifikant otosinopulmonell sjukdom. PCD-diagnos missas ofta eller försenas på grund av utmaningar med olika diagnostiska metoder. Ciliär videomikroskopi, som använder Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), ett av de diagnostiska verktygen för PCD, anses vara den optimala metoden för att utföra ciliär funktionell analys (CFA), bestående av ciliary beat frequency (CBF) och beat pattern (CBP) analys. DHSV saknar dock standardiserad, publicerad driftsprocedur för bearbetning och analys av prover. Den använder också levande andningsepitel, ett betydande infektionskontrollproblem under COVID-19-pandemin. För att fortsätta tillhandahålla en diagnostisk tjänst under denna hälsokris har ciliärvideomikroskopiprotokollet anpassats för att inkludera adekvata infektionskontrollåtgärder.

Här beskriver vi ett reviderat protokoll för provtagning och laboratoriebehandling av cilierade andningsprover, som belyser anpassningar som gjorts för att följa COVID-19-infektionskontrollåtgärder. Representativa resultat av CFA från näsborstningsprover erhållna från 16 friska försökspersoner, bearbetade och analyserade enligt detta protokoll, beskrivs. Vi illustrerar också vikten av att erhålla och bearbeta epiteliala cilierade remsor av optimal kvalitet, eftersom prover som inte uppfyller kvalitetsurvalskriterierna nu möjliggör CFA, vilket potentiellt minskar den diagnostiska tillförlitligheten och effektiviteten hos denna teknik.

Introduction

Primär ciliär dyskinesi (PCD) är en ärftlig heterogen rörlig ciliopati, där respiratoriska cilier är stationära, långsamma eller dyskinetiska, vilket leder till nedsatt mukociliär clearance och kronisk oto-sino-lungsjukdom 1,2,3,4. De kliniska manifestationerna av PCD är kronisk våthosta och kronisk nästäppa som börjar i tidig spädbarn, återkommande eller kroniska övre och nedre luftvägsinfektioner som leder till bronkiektasi och återkommande eller kronisk otitis media och bihåleinflammation 5,6,7. Ungefär hälften av PCD-patienterna uppvisar organlateralitetsdefekter såsom situs inversus eller situs ambiguus. Vissa patienter uppvisar också infertilitetsproblem på grund av orörliga spermier hos män och orörliga cilier i äggledarna hos kvinnor 1,2,8. PCD är sällsynt, men prevalensen är svår att definiera och varierar från 1:10 000 till 1:20 000 9,10. Den verkliga förekomsten av PCD tros dock vara högre på grund av svårigheter att diagnostisera och brist på klinisk misstanke. Symtom på PCD efterliknar vanliga respiratoriska manifestationer av andra akuta eller kroniska andningsbesvär, och de diagnostiska utmaningarna med att bekräfta diagnosen är välkända, vilket leder till otillräcklig behandling och uppföljning 2,5,9,11.

Ciliär videomikroskopi, med Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), är ett av de diagnostiska verktygen för PCD 4,8,12,13. DHSV anses vara den optimala metoden för att utföra ciliär funktionell analys (CFA), bestående av ciliary beat frequency (CBF) och beat pattern (CBP) analys 2,14,15,16. DHSV använder levande andningsepitel, vanligtvis erhållet från näsborstning13.

Med tanke på det nuvarande COVID-19-utbrottet är bekräftelse av en PCD-diagnos nu ännu viktigare eftersom bevis tyder på att underliggande andningssjukdomar kan leda till sämre resultat efter COVID-19-infektion17,18. En säker och effektiv PCD-diagnostiktjänst under den nuvarande pandemin kommer också att göra det möjligt för bekräftade PCD-patienter att dra nytta av ytterligare skyddsåtgärder jämfört med den allmänna befolkningen19.

Överföring av COVID-19 sker främst genom droppspridning20. Hög potential för överföring från asymtomatiska (eller minimalt symptomatiska) patienter antyds av den höga virusbelastningen i näsprov20. Dessutom, om viruspartiklar blir aerosoliserade, stannar de i luften i minst 3 timmar21. Därför utsätts vårdpersonal för en hög reservoar av virusbelastning när de utför klinisk vård och provtagning för diagnostiska tekniker22. Dessutom utsätter manipulation av levande andningsprover teknikern för COVID-19-kontaminering. Medan rekommendationer om bästa praxis för andningsläkare och ÖNH-kirurger som tar hand om COVID-19-patienter genomförs23, saknas rekommendationer för att utföra DHSV under COVID-19-pandemin.

För att fortsätta tillhandahålla en PCD-diagnostisk tjänst, samtidigt som säkerheten för vårdpersonalen (som utför provtagning) och tekniker (som utför provbehandling) säkerställs, måste protokollet för ciliär videomikroskopi anpassas under COVID-19-pandemin. Tekniken för ciliär videomikroskopi är för närvarande begränsad till forskningstjänst och specialiserade diagnostiska centra, eftersom CFA kräver omfattande utbildning och erfarenhet. Dessutom saknas för närvarande standardisering och exakt driftsförfarande för bearbetning och analys av prover med DHSV 4,13.

Syftet med denna uppsats är att beskriva standardrutiner för DHSV, med särskild hänvisning till infektionskontrollåtgärder och säkerhet vid provtagning och bearbetning av levande näsepitel. Detta kommer att göra det möjligt för högkvalitativ PCD-diagnos och vård att fortsätta, trots det nuvarande COVID-19-utbrottet.

Protocol

Godkännande erhölls från Liège sjukhusfakultets etiska kommitté och universitetsavdelningen för hygien och hälsoskydd på arbetsplatsen. 1. Provtagning av luftvägsepitel Se till att försökspersonerna är fria från infektion i minst 4-6 veckor och fria från nasal och inhalerad medicinering före provtagning. Förbered kompletterat M199-preparat: Komplettera cellodlingsmedium 199 (M199) (500 ml) med antibiotikalösning (5 ml streptomycin / penicillin (50 μg / ml)…

Representative Results

För att illustrera teknikens effektivitet presenterar vi resultaten från CFA i en serie av 16 friska vuxna frivilliga (5 män, åldersintervall 22-54 år). Näsborstningsprover från 14 (4 män, åldersintervall 24-54 år) av de totalt 16 volontärerna gav tillräckligt med lämpliga epitelkanter som uppfyllde urvalskriterierna som behövs för att utföra CFA. Från dessa 14 näsborstningsprover registrerades totalt 242 cilierade kanter och 212 kanter uppfyllde de definierade inklusionskrit…

Discussion

Detta dokument syftar till att tillhandahålla ett standardförfarande för CFA med hjälp av näsborstningsprover, med justeringar gjorda för lämpliga infektionskontrollöverväganden under COVID-19-pandemin. PCD-diagnos är utmanande och kräver för närvarande en panel med olika diagnostiska tester, enligt internationell rekommendation, inklusive nasal kväveoxidmätning, CFA med DHSV, ciliär ultrastrukturell analys med transmissionselektronmikroskopi (TEM), märkning av ciliära proteiner med immunofluorescens oc…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier och alla teammedlemmar i PCD-diagnostikcentret i Paris-Est för deras tillgänglighet och hjärtliga välkomnande under besöket på deras PCD-diagnostikcenter och de många utbytena. Vi tackar också Robert Hirst och alla teammedlemmar på PCD-centret i Leicester för deras välkomnande och tid, råd och expertis.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer
check_url/it/61949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image