Gefunctionaliseerde spirocyclische heterocyclussynthese en cytotoxiciteitstest
Summary
Hier beschrijven we een bioassay met behulp van 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) om eerder gesynthetiseerde spirocyclische oximen te testen.
Abstract
Spirocyclische heterocycli zijn onlangs in de literatuur gemeld als potentiële geneesmiddelen voor kankertherapie. De synthese van deze nieuwe orthogonale ringsystemen is een uitdaging. Een efficiënte methodologie om deze verbindingen te synthetiseren werd onlangs gepubliceerd die de vaste fasesynthese in vier stappen beschreef in plaats van de eerder gerapporteerde vijf stappen. Het voordeel van deze kortere synthese is de eliminatie van het gebruik van toxische reagentia. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-gebaseerde hars bleek cruciaal te zijn in de synthese, omdat hoogbelastende versies de toevoeging van reagentia met omvangrijke fenyl- en aromatische zijketens verhinderden. De colorimetrische 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay werd gebruikt om de cytotoxiciteit van micromolaire concentraties van deze nieuwe spirocyclische moleculen in vitro te onderzoeken. MTT is direct in de handel verkrijgbaar en produceert relatief snelle, betrouwbare resultaten, waardoor deze test ideaal is voor deze spirocyclische heterocycli. Orthogonale ringstructuren en furfurylamine (een voorloper in de synthesemethode met een vergelijkbaar 5-lids ringmotief) werden getest.
Introduction
Van kleinmolecuulremming van de interactie van E3 ubiquitine-ligase muis dubbele minuut 2 homoloog (MDM2) met p53 is bekend dat het p53-gemedieerde inductie van tumorcelapoptoseherstelt 1,2,3. MDM2 is een negatieve regulator van de p53-route en wordt vaak overexpressie in kankercellen 4,5,6,7,8,9. Recente kristallografische en biochemische studies hebben aangetoond dat kleine moleculen die een spirocyclisch raamwerk bevatten, MDM2-p53-interacties effectief kunnen remmen10. Het spirocyclische raamwerk (figuur 1, blauw gearceerd) wordt beschouwd als een geprivilegieerd motief omdat derivatisatie van dit rigide orthogonale ringsysteem heeft geleid tot de ontdekking van nieuwe therapeutische geneesmiddelen. Toegang tot deze interessante architectuur vormt een uitdaging bij het gebruik van traditionele organische synthesetechnieken. Hoewel de therapeutische effecten van spirocyclische moleculen in biologische systemen zijn onderzocht, is de synthese van deze moleculen nog steeds een omslachtig proces. Ongewenste bijproducten, het gebruik van zware omstandigheden en gevaarlijke overgangsmetalen zijn vaak problematisch.
Het potentiële gebruik van het spirocyclische motief bij de ontwikkeling van geneesmiddelen leidde tot de ontwikkeling van een protocol dat gebruik maakt van vaste-fasesynthese om een bibliotheek van moleculen met het motief te genereren naast andere uitwisselbare functionele groepen11,12. De scheiding van producten en reactanten tussen stappen kan worden bereikt door simpelweg gebruik te maken van een REM-linker bevestigd aan een harskraal en een solid-phase filtervat. Dit zou de stappen verminderen en mogelijk de opbrengsten verhogen. Deze synthetische aanpak zou een groot aantal potentiële kandidaat-geneesmiddelen kunnen opleveren. De effectiviteit van deze moleculen in een biologisch systeem zou echter verder onderzoek vereisen.
Om de cytotoxiciteit van deze spirocyclische verbindingen te bepalen, werd de MTT-assay 13,14 gebruikt. Deze methode meet de levensvatbaarheid van cellen en kan worden gebruikt om indirect de cytotoxiciteit van cellen te bepalen. Verschillende concentraties van de remmers werden toegevoegd aan gekweekte cellen in een 96-well plaat, en het aandeel levende cellen werd gemeten door colorimetrische analyse van de mate van reductie van gele MTT door mitochondriale dehydrogenasen tot de paarse formazanverbinding (figuur 2). De activiteit wordt meestal gerapporteerd als een IC50-waarde – de concentratie waarbij de celgroei met 50% wordt geremd ten opzichte van een onbehandelde controle. Dit artikel beschrijft het protocol voor de MTT-test en de voorlopige resultaten van deze nieuwe spirocyclische moleculen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De synthese van de spirocyclische verbindingen was gebaseerd op eerder onderzoek van dit laboratorium, maar met enkele wijzigingen (figuur 1)11,12. De voortgang van elke reactiestap werd gevolgd door IR-spectroscopie. Michael toevoeging van de REM linker 1 met furfurylamine voorzien van polymeer gebonden 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Uit het vo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Faculty Research Council aan K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. en J.F.M. zijn ontvangers van de Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. en B.M.R. zijn ontvangers van de STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). We zijn Dr. Matthew Berezuk en Dr. Philip Cox dankbaar voor hun begeleiding bij de bioassays.
Materials
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
Riferimenti
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- . MTT assay protocol Available from: https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol (2020)
