Функционализированный спироциклический гетероциклический синтез и анализ цитотоксичности
Summary
Здесь мы описываем биоанализ с использованием 3-(4′,5′-диметилтиазол-2′-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT) для тестирования ранее синтезированных спироциклических оксимов.
Abstract
Спироциклические гетероциклы недавно были зарегистрированы в литературе как потенциальные лекарства для терапии рака. Синтез этих новых ортогональных кольцевых систем является сложной задачей. Недавно была опубликована эффективная методология синтеза этих соединений, которая описывала синтез твердой фазы в четыре этапа, а не ранее сообщенные пять этапов. Преимуществом такого более короткого синтеза является исключение использования токсичных реагентов. Было обнаружено, что смола на основе линкера с низкой нагрузкой Regenerating Michael (REM) имеет решающее значение в синтезе, поскольку версии с высокой нагрузкой предотвращают добавление реагентов, содержащих громоздкие фениловые и ароматические боковые цепи. Колориметрический анализ 3-(4′,5′-диметилтиазол-2′-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) был использован для изучения цитотоксичности микромолярных концентраций этих новых спироциклических молекул in vitro. MTT легко доступен в продаже и дает относительно быстрые и надежные результаты, что делает этот анализ идеальным для этих спироциклических гетероциклов. Были протестированы ортогональные кольцевые структуры, а также фурфуриламин (предшественник в методе синтеза, содержащий аналогичный 5-членный кольцевой мотив).
Introduction
Известно, что низкомолекулярное ингибирование взаимодействия Е3 убиквитин-лигазы мышиным двухминутным гомологом 2 (MDM2) с р53 восстанавливает р53-опосредованную индукцию апоптоза опухолевых клеток 1,2,3. MDM2 является отрицательным регулятором пути p53 и часто чрезмерно экспрессируется в раковых клетках 4,5,6,7,8,9. Недавние кристаллографические и биохимические исследования показали, что малые молекулы, содержащие спироциклическую структуру, могут эффективно ингибировать взаимодействия MDM2-p5310. Спироциклическая структура (рисунок 1, закрашенный синим цветом) считается привилегированным мотивом, поскольку дериватизация этой жесткой ортогональной кольцевой системы привела к открытию новых терапевтических препаратов. Доступ к этой интересной архитектуре представляет собой проблему при использовании традиционных методов органического синтеза. Хотя терапевтические эффекты спироциклических молекул в биологических системах были исследованы, синтез этих молекул все еще является громоздким процессом. Нежелательные побочные продукты, использующие суровые условия, и опасные переходные металлы часто являются проблематичными.
Потенциальное использование спироциклического мотива в разработке лекарств привело к разработке протокола, использующего твердофазный синтез для создания библиотеки молекул с мотивом в дополнение к другим взаимозаменяемым функциональным группам11,12. Разделение продуктов и реагентов между стадиями может быть достигнуто простым использованием линкера REM, прикрепленного к смоляному шарику, и твердофазного фильтрующего сосуда. Это сократило бы шаги и потенциально увеличило бы урожайность. Этот синтетический подход может привести к появлению большого количества потенциальных кандидатов на лекарства. Однако эффективность этих молекул в биологической системе потребует дальнейшего изучения.
Для определения цитотоксичности этих спироциклических соединений был использован анализ МТТ13,14. Этот метод измеряет жизнеспособность клеток и может быть использован для косвенного определения цитотоксичности клеток. Различные концентрации ингибиторов добавляли к культивируемым клеткам в 96-луночной пластине, а долю живых клеток измеряли колориметрическим анализом степени восстановления желтого МТТ митохондриальными дегидрогеназами до соединения фиолетового формазана (рисунок 2). Активность чаще всего сообщается как значение IC50 – концентрация, при которой рост клеток ингибируется на 50% по сравнению с необработанным контролем. В этой статье описывается протокол анализа MTT и предварительные результаты этих новых спироциклических молекул.
Protocol
Representative Results
Discussion
Синтез спироциклических соединений был основан на предыдущих исследованиях, проведенных этой лабораторией, но с некоторыми модификациями (Рисунок 1)11,12. Ход каждой стадии реакции контролировался с помощью ИК-спектроско…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет гранта Исследовательского совета факультета K.S.H. (Управление исследований и грантов, Тихоокеанский университет Азуса-США). A.N.G. и J.F.M. являются получателями стипендии Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. и B.M.R. являются получателями грантов STEM Research Fellowship Grants (Центр исследований в области науки, Тихоокеанский университет Азуса-США). Мы благодарны доктору Мэтью Березуку и доктору Филипу Коксу за руководство по биоанализам.
Materials
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
Riferimenti
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- . MTT assay protocol Available from: https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol (2020)
