Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Thais Bascuas; Martina Kropp; Nina Harmening; Mohammed Asrih; Zsuzsanna Izsvák; Gabriele Thumann

doi:10.3791/61957

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

2.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/61957

⸱

11 dicembre 2020

Thais Bascuas¹^,² , Martina Kropp¹^,² , Nina Harmening¹^,² , Mohammed Asrih¹ , Zsuzsanna Izsvák³ , Gabriele Thumann¹^,²

¹Experimental Ophthalmology, University of Geneva, ²Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, ³Max Delbrück Center for Molecular Medicine

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per lo sviluppo e l'uso di un modello di stress ossidativo trattando le cellule epiteliali pigmentate retiniche con H₂O₂, analizzando la morfologia cellulare, la vitalità, la densità, il glutatione e il livello di UCP-2. È un modello utile per studiare l'effetto antiossidante delle proteine secrete dalle cellule trasfettate con trasposone per trattare la degenerazione neuroretinica.

Abstract

Lo stress ossidativo svolge un ruolo fondamentale in diverse malattie degenerative, tra cui la degenerazione maculare legata all'età (AMD), una patologia che colpisce circa 30 milioni di pazienti in tutto il mondo. Porta ad una diminuzione dei fattori neuroprotettivi sintetizzati dall'epitelio pigmentato retinico (RPE), ad esempio il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), seguiti dalla perdita di cellule RPE e infine dalla morte dei fotorecettori e delle cellule gangliari retiniche (RGC). Ipotizziamo che la ricostituzione dell'ambiente retinico neuroprotettivo e neurogenico mediante trapianto subretinico di cellule RPE trasfettate sovraesprimendo PEDF e GM-CSF abbia il potenziale per prevenire la degenerazione retinica mitigando gli effetti dello stress ossidativo, inibendo l'infiammazione e sostenendo la sopravvivenza cellulare. Utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata nel Bosco(SB100X)le cellule RPE umane sono state trasfettate con i geni PEDF e GM-CSF e hanno mostrato un'integrazione genica stabile, un'espressione genica a lungo termine e una secrezione proteica utilizzando qPCR, western blot, ELISA e immunofluorescenza. Per confermare la funzionalità e la potenza del PEDF e del GM-CSF secreti dalle cellule RPE trasfettate, abbiamo sviluppato un test in vitro per quantificare la riduzione dello stress ossidativo indotto da H₂O₂sulle cellule RPE in coltura. La protezione cellulare è stata valutata analizzando la morfologia cellulare, la densità, il livello intracellulare di glutatione, l'espressione genica UCP2 e la vitalità cellulare. Sia le cellule RPE trasfettate che sovraesprimono PEDF e/o GM-CSF che le cellule non trasfettate ma pretrattate con PEDF e/o GM-CSF (disponibili in commercio o purificate da cellule trasfettate) hanno mostrato una significativa protezione delle cellule antiossidanti rispetto ai controlli non trattati. L'attuale modello H₂O₂è un approccio semplice ed efficace per valutare l'effetto antiossidante di fattori che possono essere efficaci per il trattamento di AMD o malattie neurodegenerative simili.

Introduzione

Il modello qui descritto, offre un approccio utile per valutare l'efficienza degli agenti biofarmaceutici per ridurre lo stress ossidativo nelle cellule. Abbiamo utilizzato il modello per studiare gli effetti protettivi di PEDF e GM-CSF sullo stress ossidativo mediato da H₂O₂sulle cellule epiteliali pigmentate retiniche, che sono esposte ad alti livelli di O₂e luce visibile, e la fagocitosi delle membrane del segmento esterno dei fotorecettori, generando livelli significativi di specie reattive dell'ossigeno (ROS)¹^, ². Sono considerati un importante contributo alla patogenesi ....