Denne protokol har til formål at fremstille 3D hjerte sfæroider (CSs) ved co-dyrkning celler i hængende dråber. Kollagen-indlejrede CS’er behandles med doxorubicin (DOX, et kardiotoksisk middel) ved fysiologiske koncentrationer for at modellere hjertesvigt. In vitro-test ved hjælp af DOX-behandlede CS’er kan anvendes til at identificere nye behandlinger for hjertesvigt patienter.
På trods af adskillige fremskridt inden for hjertevævsteknik er en af de største udfordringer at overvinde fortsat generationen af et fuldt funktionelt vaskulært netværk, der omfatter flere niveauer af kompleksitet for at give ilt og næringsstoffer i bioengineered hjertevæv. Vores laboratorium har udviklet en tre-dimensionel in vitro model af det menneskelige hjerte, kendt som “hjerte sfæroide” eller “CS”. Dette præsenterer biokemiske, fysiologiske og farmakologiske træk typisk for det menneskelige hjerte og genereres ved co-culturing sine tre store celletyper, såsom hjerte myocytter, endotelceller, og fibroblaster. Humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller ICMs) er co-kulturperler ved nøgletal, der tilnærmer dem, der findes in vivo med humane hjertefiberblaster (HCF’er) og humane koronararterieceller (HCAEC) i hængende dråbekulturplader i tre til fire dage. Den konfokale analyse af CSs farves med antistoffer mod hjerte Troponin T, CD31 og vimentin (markører for hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis) viser, at CSs præsentere en kompleks endotel celle netværk, der ligner den indfødte findes i det menneskelige hjerte. Dette bekræftes af 3D-gengivelsesanalysen af disse konfokale billeder. CSs også præsentere ekstracellulære matrix (ECM) proteiner typisk for det menneskelige hjerte, såsom kollagen type IV, laminin og fibronectin. Endelig, CSs præsentere en kontraktile aktivitet målt som syncytial kontraktilitet tættere på den ene typisk for det menneskelige hjerte i forhold til CSs, der indeholder iCMs kun. Når det behandles med et kardiotoksisk anti-cancer-middel, såsom doxorubicin (DOX, anvendes til behandling af leukæmi, lymfom og brystkræft), er levedygtigheden af DOX-behandlede CS’er væsentligt reduceret ved 10 μM genetisk og kemisk hæmning af endotelnitriske oxidsyntase, et nedstrøms mål for DOX i HCF’er og HCAECs, reduceret sin toksicitet i CSs. I betragtning af disse unikke funktioner, er CSs i øjeblikket bruges som in vitro modeller til at studere hjerte biokemi, patofysiologi, og farmakologi.
Det menneskelige hjerte har en begrænset regenerativ kapacitet, mens hjerte-kar-sygdom (CVD) fortsat er den vigtigste dødsårsag på verdensplan på trods af de seneste fremskridt inden for vævsteknik og stamcelleteknologier1. Behovet for nye terapeutiske herunder molekylære og cellulære tilgange til enten at reparere et beskadiget hjerte eller for at forhindre et hjerte i at mislykkes, er en af de vigtigste aktuelle kliniske behov forpatienter,der lider afhjertesygdomme 2,3,4. Hovedformålet med hjertevæv engineering er at fremstille en tre-dimensionel (3D) hjertevæv, der præsenterer molekylære, cellulære og ekstracellulære funktioner typisk for et menneskeligt hjerte, herunder dens vaskulære netværk og fysiologiske kontraktilefunktion 4,5,6.
For at bioengineer og fremstille en funktionel human hjertevæv, der efterligner det menneskelige hjerte for in vitro og in vivo applikationer, flere tilgange er blevet undersøgt, herunder manipuleret hjerte væv (EHTs), celleark og sfæroide kulturer7,8. Men disse væv mislykkes ved at opsummere den optimale 3D mikromiljø typisk for det menneskelige hjerte og deres potentielle anvendelse for CVD patienter kan ikke direkte oversætte fra bænken til sengen7. Dette skyldes, at de ikke opsummere den komplekse biologi, morfologi, og fysiologi in vivo hjerte væv9. En af de største udfordringer i hjertevæv engineering omfatter udvikling af et hierarkisk vaskulært netværk inden for bioengineered hjertevæv, som ethvert væv, der er større end 200 μm i diameter udvikler celledød i midten2,10. En korrekt dannet vaskulære netværk i et humant hjerte væv spiller en stor rolle for levering af blod, ilt og næringsstoffer til hjerteceller11. Under embryonal udvikling dannes koronarkapiller og arterier via vaskculogenese (de novo blodkardannelse) og angiogenese (generering af blodkar fra allerede eksisterende) fra endotelædecelleceller8,12. Hjertefibroblaster spiller også en stor rolle i korrekt vaskulær netværksdannelse ved at give den optimale ekstracellulære matrix (ECM) ogvækstsammensætning 13,14.
3D-vaskulære netværk af bioengineered hjertevæv styrer cellernes overlevelse og funktion ved at skabe ilt- og næringsstofgradienter og parakriminel signalering, såsom homotypiccelleinteraktion, heterotypcelleinteraktion, interaktion mellem celler gennem udskillede opløselige proteiner og celler til ECM-interaktioner3,10,15,16,17,18. Dette forhindrer celledød midt i vævet og fremmer cellernes levedygtighed og fysiologiske funktion i bioengineered hjertevæv16,18,19.
Sfæroide kulturer fra stamceller er for nylig blevet udforsket som in vitro modeller af det menneskelige hjerte20. For yderligere at forbedre hjertetmikromiljø in vitro, har de inkluderet brugen af alle de vigtigste celletyper findes i det menneskelige hjerte, såsom hjerte myocytter, endotelceller, og fibroblaster. Sfæriske kulturer præsentere den nødvendige 3D strukturelle støtte til celler til at vokse og funktion og kan bruges til bioengineer et vaskulært netværk14,20,21,22. I denne sammenhæng har vores laboratorium udviklet menneskelige hjerte sfæroider (CSs) ved co-culturing hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster på nøgletal findes i det menneskelige hjerte14. Denne model er en udvidelse af rotte ventrikulære hjerteceller sfæriske model, genereret af co-culturing hjerteceller i hængende drop kulturer, der anvendes til at modellere hjertefibrose21. Humane CSs kan bruges som toksicitet analyser ved at behandle dem doxorubicin (DOX, en anti-cancer agent, der anvendes til behandling af leukæmi, lymfom og brystkræft), som er velkendt for at fremkalde hjertefibrose og hjertesvigt (HF) selv 17 år efter sin somministration14.
I dette manuskript beskriver vi, hvordan man genererer menneskelige CS’er ved at co-dyrke humane inducerede pluripotente stamceller afledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller ICMs), humane hjertefiberblaster (HCF’er) og humane koronararterie endotelceller (HCAECs) i hængende drop kulturer. For at bruge og billede CSs til in vitro test, er de indlejret i en kollagen gel. Den konfokale analyse af CS’er, der er besynet med antistoffer mod CD31, en markør for endotelceller, viste, at disse celler danner et netværk svarende til det, der blev observeret in vivo. For at fremkalde HF og potentielt teste nye midler, der kan behandle eller forhindre det, blev CS’er behandlet med 10 μM DOX (en koncentration fundet i blodbanen hos kræftpatienter, der fik lægemidlet). Når plettet med calcein-AM og ethidium homodimer (farvning levende og døde celler, henholdsvis), DOX-behandlede CSs udgør et betydeligt fald i levedygtigheden i forhold til CSs, der ikke fik stoffet. CS’er præsenterer også en homogen kontraktileaktivitet, når de er i gang med at anvende potentiel stimulering i marken mellem 1 og 3 Hz.
Udviklingsmæssigt, korrekt vaskulære netværk dannelse er afgørende for dannelsen af funktionelle væv, herunder det menneskelige hjerte10,12,23,24,25,26. Hensyntagen til korrekt vaskularisering af 3D-væv gør det muligt at udveksle ilt, vækstfaktorer, signalmolekyler og næringsstoffer, hvilket forhindrer udviklingen af cellenekrose i væv, der er tykkere end 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. I øjeblikket fås in vitro 3D hjerte modeller, der præsenterer en vaskulær netværk er primært præsenterer kapillær størrelse, uorganiserede vaskulære netværk og mangler hierarkiske komplekse forgrenede vaskularisering observeret in vivo6,8,29. Den alternative metode til udvikling af et komplekst hjerteendotelcellenetværk , der er beskrevet i dette manuskript , giver forbedret celle levedygtighed og funktion sammenlignet med eksisterende modeller (figur 1)14,22. 3D in vitro CSs modellerer det menneskelige hjerte ved bedre at opsummere dets in vivo mikromiljø, herunder dets molekylære, cellulære og ekstracellulærekomponenter 14,22. CS-generation fra stamceller-afledte celler i de hængende dråber tillader deres kulturer under definerede forhold (f.eks. celletyper og forhold, korrekt vævsdannelse). Co-kulturer af iCMs sammen med HCF’er og HCAECs inden for CSs definere molekylære og cellulære krydstale, der regulerer hjertet patofysiologi, herunder dens kontraktile funktion og reaktion på lægemidler i koncentrationer findes i patientens blodbanen14. På grund af disse unikke funktioner, CSs er blevet udnyttet til model hjertefibrose, en alvorlig konsekvens af myokardie infarkt og hjertesvigt21. Vores tidligere undersøgelser viste, hvordan tilstedeværelsen af både endotelceller og fibroblaster er afgørende for rekapitulation af det vaskulære mikromiljø i det menneskelige hjerte, så den optimale aflejring af fibroblast-afledte ECM-proteiner, såsom laminin, fibronectin og kollagen type IV, lokaliseret i nærheden af en udviklende endotelcellenetværk14,21.
DOX er et velkendt kardiotoksisk lægemiddel, der kan udvikle hjertesvigt hos kræftpatienter selv 17 år efter deres behandling30. Ikke desto mindre er det stadig et lægemiddel valg til behandling af leukæmi og lymfom hos pædiatriske patienter og brystkræft hos kvinder30. DOX-behandling i CS’er er derefter blevet brugt til at modellere hjertesvigt (HF) in vitro til at undersøge både de mekanismer, der regulerer toksiciteten i hjertemykumytter, endotelceller og fibroblaster14 og til model HF-induceret hjertefibrose21. Cellegennemsyrenheden blev statistisk reduceret i DOX-behandlede CS’er inden for 24 timer, når de blev eksponeret for lægemidlet ved den koncentration, der blev fundet i blodbanen hos kræftpatienter (mellem 5 og 10 μM)14 (Figur 2). Tidligere undersøgelser i vores laboratorium viste også de toksiske virkninger af DOX på både hjerte endotelceller og fibroblaster via endotelnitriske nitrogenoxidsyntase (eNOS) ved hjælp af både genetiske og kemiske hæmmere af denne signalvej14. Brugen af genetiske (NOS3 shRNA) og kemiske (N5-(1-iminoethyl)-L-ornithin, dihydrochlorid eller L-NIO) antagonister af eNOS-signalvejen som nedstrømsmål for DOX forhindrede dens toksiske virkninger i både hjerteendotelceller og fibroblaster14.
Kontraktile aktivitet inden for CS’er er også blevet målt takket være den elektriske kobling af hjerteceller, når de udsættes for felt potentiel stimulation. Vi fandt, at CSs dyrket med kontrolmedier (DOX 0 μM) kontrakt spontant og homogent med en slåhastighed, der kan tempoet ved feltstimulering inden for 1 og 3 Hz, sammenlignes med et sundt menneskeligt hjerte. På den anden side følger DOX-behandlede CS’er ikke den elektriske stimulering, da de ikke kan indgå kontrakter. Sammen med målinger af celle levedygtighed og toksicitet ved hjælp af calcein-AM og ethidium homodimer, denne funktionelle analyse for CS kontraktile funktion tillader evaluering af det komplekse scenario typisk for det menneskelige hjerte in vitro, i øjeblikket ikke opnåelige med andre modeller. Sammenlignet med kontraktile aktivitetsmålinger af enkelt hjerteceller ved hjælp af det samme system er vi ikke i stand til at visualisere og måle sarkom i CS’er. Derfor er vi begrænset til målinger af % sfæroid afkortning over tid, en analyse, vi var nødt til at udvikle inden for vores laboratorium. Da vi kontrollerer antallet af celler, vi co-kultur i hver CS og derfor størrelsen af hver CS, vi udnytter CSs med samme størrelse, der faktisk præsentere homogene kontraktile funktion. Men selv hvis vi genererede CSs af forskellige størrelser, deres kontraktile aktivitet ikke ændre sig.
Det er også vigtigt at rapportere, at den flercellede karakter af CSs gør dem tunge nok til at lokalisere i bunden af coverslip i Ion-Optix-systemet, selv hvis de er superfunderet. Baseret på det faktum, at CSs sidde af sig selv i en bestemt position, behøver vi ikke at gøre dem overholde dækslet, tværtimod, hvad der almindeligvis gøres med enkelt hjerteceller i de fleste laboratorier.
Den mikroskopiske analyse af CS’er, der er besinklet med antistoffer mod hjertetroponin T, CD31/PECAM og PECAM (som markører for henholdsvis ICM’er, HCAEC’er og HCF’er) viste dannelsen af et endotelcellenetværk (Figur 1, blå). For fuldt ud at udelukke nekrose i den indre del af CS’er blev rumlig vurdering af cellernes levedygtighed udført i vores laboratorium ved konfokal analyse af calcein-AM/ethidium homodimer farvede CS’er (data ikke vist). Det er imidlertid vigtigt at erkende, at den fremtidige udvikling på biofabrikationsområdet bedre kan opsummere andre komplekse træk, der er typiske for det menneskelige hjerte in vivo, som i øjeblikket ikke findes i den eksisterende model. Disse omfatter: i) kontraktile funktion typisk for voksne kardiomyocytter; ii) blodgennemstrømning og trykkræfter; iii) parakritiske signalering; iv) immunrespons, som vil være afgørende for at forbedre denne og andre in vitro hjertemodeller6. Som enhver anden model har til formål at opsummere de vigtigste træk ved enten et sundt væv eller en sygdom tilstand, protokollen for generering og brug af CS beskrevet i dette manuskript har til formål at hjælpe forskeren til at løse specifikke spørgsmål, der kan ikke være udtømmende ved hjælp af denne tilgang. For eksempel, den potentielle brug af patient-afledte celler til generering af CSs ville give værktøjer til personlig medicin, i øjeblikket ikke tilgængelig ved hjælp af almindeligt tilgængelige high-throughput assays for hjerte-kar-forskning.
Afslutningsvis viste vi en enkel måde at opsummere det menneskelige hjerte mikromiljø ved hjælp af hjerteceller. Cardiac sfæroider præsentere en endotel celle netværk, der bedre opsummerer den ene til stede i det menneskelige hjerte i forhold til monolag kulturer af hjerteceller. I betragtning af deres unikke funktioner, repræsenterer de avancerede værktøjer til in vitro-test for hjerte-kar-forskning. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af patient-afledte celler kunne give muligheder for personlig medicin og nye behandlingsformer til både at forebygge og bedre behandle hjerte-kar-sygdom.
The authors have nothing to disclose.
En særlig tak til Nat Johnston for optagelsen og redigering af videoen.
Poonam Sharma blev støttet af University of Newcastle med UNIPRS og UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) stipendier. Carmine Gentile blev støttet af en UTS Seed Funding, katolske ærkebispedømme i Sydney Grant for Adult Stem Cell Research og en Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |