Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom
Summary
Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.
Abstract
Mausmodelle spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung und ermöglichen die Untersuchung von Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese, einschließlich der veränderten Ionenkanalfunktion und des Kalziumhandlings. Zu diesem Zweck sind atriale oder ventrikuläre Kardiomyozyten von hoher Qualität notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen oder Calcium-Handling-Anomalien zu untersuchen. Die begrenzte Ausbeute an qualitativ hochwertigen Kardiomyozyten, die mit den derzeitigen Isolationsprotokollen gewonnen wird, erlaubt jedoch nicht beide Messungen in derselben Maus. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion für die anschließende simultane Messung von Calciumtransienten und L-Typ-Calciumstrom von einem Tier. Mäuseherzen werden gewonnen, und die Aorta wird schnell kanüliert, um Blut zu entfernen. Die Herzen werden dann zunächst mit einer kalziumfreien Lösung (37 °C) perfundiert, um das Gewebe auf der Ebene der interkalierten Bandscheiben zu dissoziieren, und anschließend mit einer Enzymlösung, die wenig Kalzium enthält, um die extrazelluläre Matrix (37 °C) zu stören. Das verdaute Herz wird anschließend in Vorhöfe und Ventrikel zerlegt. Gewebeproben werden in kleine Stücke zerkleinert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren aufgelöst. Die enzymatische Verdauung wird gestoppt und die Zellen werden schrittweise wieder in physiologische Kalziumkonzentrationen gebracht. Nach Beladung mit einem fluoreszierenden Ca2+-Indikator werden isolierte Kardiomyozyten für die simultane Messung von Calciumströmen und -transienten präpariert. Darüber hinaus werden Isolationsfallstricke diskutiert und Patch-Clamp-Protokolle und repräsentative Spuren von L-Typ-Calciumströmen mit simultanen Calciumtransientenmessungen in atrialen und ventrikulären murinen Myozyten, die wie oben beschrieben isoliert wurden, bereitgestellt.
Introduction
Herzrhythmusstörungen sind weit verbreitet und eine der größten Herausforderungen im Gesundheitswesen, da sie Millionen von Menschen weltweit betreffen. Herzrhythmusstörungen sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität assoziiert 1,2 und stellen die zugrunde liegende Ursache für die Mehrzahl der plötzlichen Herztodedar 3. Heutige Behandlungsoptionen haben das Überleben der Patienten verbessert, sind aber immer noch hauptsächlich symptomatische Behandlungen, anstatt auf die zugrunde liegenden Mechanismen abzuzielen. Daher sind diese Behandlungen nur begrenzt wirksam und können häufig schwere Nebenwirkungen verursachen 4,5,6. Eine Verbesserung der derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten erfordert Einblicke in die zugrunde liegende Pathophysiologie, was die Notwendigkeit geeigneter Modelle für die Untersuchung schafft. Kleintiermodelle – und insbesondere Mausmodelle – spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung, da sie es ermöglichen, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen, z. B. den genetischen Einfluss auf die zelluläre Elektrophysiologie, die Funktion der Ionenkanäle oder den Umgang mit Kalzium 7,8.
Zu diesem Zweck werden isolierte atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten in ausreichender Menge und Viabilität benötigt. Ein breites Spektrum unterschiedlicher Isolationsansätze zur Gewinnung von atrialen und ventrikulären Myozyten wurde bereits beschrieben 9,10,11,12,13, und einige Gruppen haben Daten aus gleichzeitigen Messungen von L-Typ-Strom und Kalziumstrom-induzierten Kalziumtransienten entweder aus dem Vorhof 14 oder dem Ventrikel 15 vorgelegt Kardiomyozyten der Maus. Unseres Wissens nach liegen jedoch keine Daten zu Vorhof- und Ventrikelmessungen eines Tieres vor. Die Forscher konzentrieren sich auf eine breite Palette von Themen, die von Elektrophysiologie über Proteomik, funktionelle Studien wie Zellkontraktilität oder Proteininteraktionen, mitochondriale Funktion bis hin zur Genetik reichen – alle benötigen isolierte Kardiomyozyten. Viele der veröffentlichten Protokolle wurden daher nicht speziell für Patch-Clamp-Studien entwickelt, was zu begrenzten Ausbeuten und unzureichender Zellqualität für Patch-Clamp-Studien führt. Daher können simultane Patch-Clamp- und Calcium-Transientenmessungen von Vorhof- und Ventrikelzellen, die aus einem Tier isoliert wurden, mit etablierten Protokollen nicht durchgeführt werden.
Die Isolierung von murinen – insbesondere atrialen – Myozyten für Patch-Clamp-Experimente ist nach wie vor eine Herausforderung. Dieser Artikel stellt eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion vor, die anschließend die gleichzeitige Messung von Nettomembranstrom und strominduzierten Kalziumtransienten von einem Tier ermöglicht. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit genetischen Mutationen ausgearbeitet. Dieses Protokoll kann sowohl für männliche als auch für weibliche Mäuse verwendet werden. Die Myozytenisolierung, die Bilder und die repräsentativen Ergebnisse, die unten beschrieben werden, wurden von Wildtyp-C57Bl/6-Mäusen im Alter von 6 (± 1) Monaten erhalten. Nichtsdestotrotz wurde dieses Protokoll erfolgreich bei Mäusen im Alter von 2 bis 24 Monaten mit unterschiedlichen Genotypen eingesetzt. Abbildung 1 zeigt den Isolationsaufbau und eine Nahaufnahme eines kanülierten Herzens während der Enzymperfusion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel bietet eine einfache und funktionelle Möglichkeit, qualitativ hochwertige atriale und ventrikuläre Myozyten von derselben Maus für Patch-Clamp-Studien mit gleichzeitigen transienten Kalziumableitungen zu erhalten. Die Qualität der gewonnenen Daten hängt stark von der Qualität der Zellisolierung ab. Wie oben erwähnt, wurden bereits viele Verfahren zur Isolierung von murinen Kardiomyozyten beschrieben 9,10,11,12.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 an P. Tomsits und D. Schüttler; VO1568/3-1, IGK 1816 und SFB1002 Projekt A13 bis N. Voigt), Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder (EXC 2067/1- 390729940 an N. Voigt), Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss und N. Voigt; 81Z0600206 an S. Kääb), die Corona-Stiftung (S199/10079/2019 an S. Clauss), das ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 an S. Clauss), die Heinrich-und-Lotte-Mühlfenzl-Stiftung (an S. Clauss) und die Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS 2016_A20 an N. Voigt). Die Geldgeber spielten bei der Vorbereitung des Manuskripts keine Rolle.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
Riferimenti
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