Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리
Summary
마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.
Abstract
마우스 모델은 부정맥 연구에서 중요한 역할을 하며 변경된 이온 채널 기능 및 칼슘 처리를 포함한 부정맥 생성의 주요 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이를 위해 고품질의 심방 또는 심실 심근 세포는 패치 클램프 측정을 수행하거나 칼슘 취급 이상을 탐색하는 데 필요합니다. 그러나 현재 격리 프로토콜에 의해 얻어진 고품질 심근 세포의 제한된 수율은 동일한 마우스에서 두 측정을 모두 허용하지 않습니다. 이 기사에서는 역행성 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하여 한 동물에서 칼슘 과도 현상 및 L형 칼슘 전류를 동시에 측정하는 방법을 설명합니다. 마우스 심장을 채취하고, 대동맥을 빠르게 캐뉼라 화하여 혈액을 제거합니다. 그런 다음 심장은 처음에 칼슘이 없는 용액(37°C)으로 관류되어 삽입된 디스크 수준에서 조직을 해리한 다음 세포외 기질(37°C)을 파괴하기 위해 칼슘이 거의 포함되지 않은 효소 용액으로 관류합니다. 소화 된 심장은 이후 심방과 심실로 해부됩니다. 조직 샘플을 작은 조각으로 잘게 썰고 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 용해시킵니다. 효소 소화가 중단되고 세포가 생리적 칼슘 농도로 단계적으로 재도입됩니다. 형광 Ca2+ 지시약으로 로딩 한 후, 칼슘 전류와 과도 현상을 동시에 측정하기 위해 분리 된 심근 세포를 준비합니다. 또한, 분리 함정이 논의되고, 위에서 설명한 바와 같이 분리된 심방 및 심실 쥐 근세포에서 동시 칼슘 과도 측정과 함께 L형 칼슘 전류의 패치 클램프 프로토콜 및 대표적인 흔적이 제공됩니다.
Introduction
심장 부정맥은 흔하며 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치기 때문에 현재 주요 의료 문제 중 하나입니다. 부정맥은 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있으며1,2 대부분의 심장 돌연사3의 근본 원인이다. 최신 치료 옵션은 환자 생존율을 향상시켰지만 여전히 기본 메커니즘을 표적으로 삼기보다는 주로 대증 치료입니다. 따라서, 이러한 치료법은 효능이 제한적이며 종종 심각한 부작용을 일으킬 수 있다 4,5,6. 현재 치료 옵션을 개선하려면 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력이 필요하므로 연구에 적합한 모델이 필요합니다. 작은 동물 모델, 특히 마우스 모델은 부정맥 생성의 주요 메커니즘, 예를 들어 세포 전기 생리학, 이온 채널 기능 또는 칼슘 처리에 대한 유전 적 영향을 연구 할 수 있기 때문에 부정맥 연구에서 중요한 역할을합니다 7,8.
이를 위해서는 충분한 양과 생존력을 가진 고립 된 심방 및 심실 심근 세포가 필요합니다. 심방 및 심실 근세포를 얻기 위한 다양한 분리 접근법의 광범위한 스펙트럼이 이전에 설명되었으며9,10,11,12,13 일부 그룹은 심방 14 또는 심실 15에서 L형 전류 및 칼슘 전류 유도 칼슘 과도 현상의 동시 측정 데이터를 제시했습니다 쥐 심근 세포. 그러나 우리가 아는 한 동물의 심방 및 심실 측정에 대한 데이터는 없습니다. 연구자들은 전기생리학에서 단백질체학, 세포 수축성 또는 단백질 상호 작용과 같은 기능 연구, 미토콘드리아 기능 또는 유전학에 이르기까지 다양한 주제에 중점을 두고 있으며, 이 모든 것은 분리된 심근 세포를 필요로 합니다. 따라서 발표된 프로토콜 중 다수는 패치 클램프 연구를 위해 특별히 개발되지 않았기 때문에 패치 클램프 연구를 위한 수율이 제한되고 세포 품질이 불충분했습니다. 따라서 한 동물에서 분리된 심방 및 심실 세포의 동시 패치 클램프 및 칼슘 과도 측정은 확립된 프로토콜로 수행할 수 없습니다.
패치 클램프 실험을 위한 쥐, 특히 심방 근세포의 분리는 여전히 어려운 과제입니다. 이 기사는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 제공하며, 이를 통해 한 동물에서 순 막 전류와 전류 유도 칼슘 과도 현상을 동시에 측정할 수 있습니다. 이 기사는 야생형 마우스와 유전적 돌연변이를 가진 마우스에서 파생된 심방 및 심실 근세포의 분리를 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 수컷과 암컷 마우스 모두에 사용할 수 있습니다. 아래에 기술된 근세포 분리, 이미지 및 대표적인 결과는 6개월(± 1)개월의 야생형 C57Bl/6 마우스에서 얻었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 상이한 유전자형을 갖는 2개월에서 24개월에 이르는 다양한 연령의 마우스에 성공적으로 사용되었다. 그림 1 은 효소 관류 중 캐뉼러화된 심장의 분리 설정 및 확대 사진을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사는 동시 칼슘 과도 기록과 함께 패치 클램프 연구를 위해 동일한 마우스에서 고품질 심방 및 심실 근세포를 얻을 수 있는 쉽고 기능적인 방법을 제공합니다. 얻어진 데이터의 품질은 세포 분리의 품질에 크게 의존한다. 상기 언급한 바와 같이, 쥐 심근세포를 단리하는 많은 방법들이 이전에 기술되었다 9,10,11,12.…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 독일 연구 재단 (DFG; 혈관 의학의 임상의 과학자 프로그램(PRIME), MA 2186/14-1 to P. Tomsits 및 D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 및 SFB1002 프로젝트 A13 to N. Voigt), 독일 우수 전략(Excellence Strategy)에 따른 독일 연구 재단(EXC 2067/1- 390729940 to N. Voigt), 독일 심혈관 연구 센터(German Centre for Cardiovascular Research, DZHK; 81X2600255 to S. Clauss and N. Voigt; 81Z0600206 to S. Kääb), 코로나 재단(Corona Foundation) (S199/10079/2019 to S. Clauss), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게) 및 Else-Kröner-Fresenius 재단 (EKFS 2016_A20에서 N. Voigt까지). 자금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
Riferimenti
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
