Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu
Summary
Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.
Abstract
Fare modelleri, aritmi araştırmalarında çok önemli bir rol oynar ve değiştirilmiş iyon kanalı fonksiyonu ve kalsiyum kullanımı dahil olmak üzere aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak veya kalsiyum işleme anormalliklerini araştırmak için yüksek kalitede atriyal veya ventriküler kardiyomiyositler gereklidir. Bununla birlikte, mevcut izolasyon protokolleri ile elde edilen yüksek kaliteli kardiyomiyositlerin sınırlı verimi, aynı farede her iki ölçüme de izin vermez. Bu makalede, bir hayvandan kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare kalpleri elde edilir ve kanı çıkarmak için aort hızla kanüle edilir. Kalpler daha sonra başlangıçta dokuyu intercalated diskler seviyesinde ayrıştırmak için kalsiyumsuz bir çözelti (37 ° C) ve daha sonra hücre dışı matrisi (37 ° C) bozmak için az miktarda kalsiyum içeren bir enzim çözeltisi ile perfüze edilir. Sindirilen kalp daha sonra atriyum ve ventriküllere diseke edilir. Doku örnekleri küçük parçalar halinde doğranır ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme ile çözülür. Enzimatik sindirim durdurulur ve hücreler fizyolojik kalsiyum konsantrasyonlarına kademeli olarak yeniden verilir. Bir floresan Ca2 + göstergesi ile yüklendikten sonra, kalsiyum akımlarının ve geçicilerinin eşzamanlı ölçümü için izole kardiyomiyositler hazırlanır. Ek olarak, izolasyon tuzakları tartışılmış ve yukarıda tarif edildiği gibi izole edilmiş atriyal ve ventriküler murin miyositlerinde eşzamanlı kalsiyum geçici ölçümleri ile yama-kelepçe protokolleri ve L-tipi kalsiyum akımlarının temsili izleri sağlanmıştır.
Introduction
Kardiyak aritmiler yaygındır ve dünya çapında milyonlarca insanı etkilediği için mevcut en büyük sağlık sorunlarından biridir. Aritmiler yüksek morbidite ve mortaliteile ilişkilidir 1,2 ve ani kardiyak ölümlerin çoğunun altında yatan nedeni oluşturur3. Güncel tedavi seçenekleri hasta sağkalımını iyileştirmiştir, ancak yine de altta yatan mekanizmaları hedeflemek yerine esas olarak semptomatik tedavilerdir. Bu nedenle, bu tedavilerin etkinliği sınırlıdır ve sıklıkla ciddi yan etkilere neden olabilir 4,5,6. Mevcut tedavi seçeneklerinin iyileştirilmesi, altta yatan patofizyolojinin anlaşılmasını gerektirmekte ve çalışmak için uygun modellere ihtiyaç duyulmaktadır. Küçük hayvan modelleri – ve özellikle fare modelleri – aritmi araştırmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır, çünkü aritmogenezin temel mekanizmalarını, örneğin hücresel elektrofizyoloji, iyon kanalı fonksiyonu veya kalsiyum işleme üzerindeki genetik etkiyi incelemeye izin verirler7,8.
Bu amaçla, yeterli miktarda ve canlılıkta izole atriyal ve ventriküler kardiyomiyositler gereklidir. Atriyal ve ventriküler miyositleri elde etmek için farklı izolasyon yaklaşımlarının geniş bir spektrumu daha önce 9,10,11,12,13 olarak tanımlanmıştır ve bazı gruplar atriyal 14 veya ventriküler15’ten L-tipi akım ve kalsiyum akımına bağlı kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı ölçümlerinden elde edilen verileri sunmuştur murin kardiyomiyositler. Bununla birlikte, en iyi bildiğimiz kadarıyla, bir hayvandan elde edilen atriyal ve ventriküler ölçümler hakkında hiçbir veri yoktur. Araştırmacılar, elektrofizyolojiden proteomiklere, hücre kontraktilitesi veya protein etkileşimleri, mitokondriyal fonksiyon veya genetik gibi fonksiyonel çalışmalara kadar çok çeşitli konulara odaklanmaktadır – hepsi izole kardiyomiyositlere ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle yayınlanan protokollerin birçoğu yama kelepçesi çalışmaları için özel olarak geliştirilmemiştir, bu da yama kelepçesi çalışmaları için sınırlı verime ve yetersiz hücre kalitesine yol açmaktadır. Bu nedenle, bir hayvandan izole edilen atriyal ve ventriküler hücrelerin eşzamanlı yama kelepçesi ve kalsiyum geçici ölçümleri, belirlenmiş protokollerle gerçekleştirilemez.
Yama kelepçesi deneyleri için murin – özellikle atriyal – miyositlerin izolasyonu zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu için basit ve hızlı bir yöntem sunmaktadır, bu da daha sonra bir hayvandan hem net membran akımının hem de akımın neden olduğu kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı ölçümlerine izin vermektedir. Bu makalede, vahşi tip farelerden ve genetik mutasyonlar taşıyan farelerden türetilen atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu için bir protokol detaylandırılmıştır. Bu protokol hem erkek hem de dişi fareler için kullanılabilir. Aşağıda tarif edilen miyosit izolasyonu, görüntüler ve temsili sonuçlar, 6 (± 1) aylıkken vahşi tip C57Bl / 6 farelerden elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, farklı genotiplere sahip 2 ila 24 ay arasında değişen çeşitli yaşlardaki fareler için başarıyla kullanılmıştır. Şekil 1 , enzim perfüzyonu sırasında kanüle olmuş bir kalbin izolasyon kurulumunu ve yakın çekimini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, eşzamanlı kalsiyum geçici kayıtları ile yama-kelepçe çalışmaları için aynı fareden yüksek kaliteli atriyal ve ventriküler miyositler elde etmenin kolay ve işlevsel bir yolunu sunmaktadır. Elde edilen verilerin kalitesi büyük ölçüde hücre izolasyonunun kalitesine bağlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, murin kardiyomiyositlerini izole etmek için birçok yöntem daha önce 9,10,11,12 olarak tanımlanmıştır.<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG; Vasküler Tıpta Klinisyen Bilim İnsanı Programı (PRIME), P. Tomsits ve D. Schüttler’e MA 2186/14-1; VO1568/3-1, IRTG1816 ve SFB1002 projesi A13’ten N. Voigt’e), Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında Alman Araştırma Vakfı (EXC 2067/1- 390729940’den N. Voigt’e), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255’ten S. Clauss ve N. Voigt’e; 81Z0600206’dan S. Kääb’a), Korona Vakfı (S199/10079/2019’dan S. Clauss’a), Kardiyovasküler Hastalıklar ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910’dan S. Clauss’a), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Vakfı (S. Clauss’a) ve Else-Kröner-Fresenius Vakfı (EKFS 2016_A20 N. Voigt’e). Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
Riferimenti
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
