En mångsidig mikrofluidisk anordning beskrivs som möjliggör kristallisering av ett enzym med hjälp av motdiffusionsmetoden, införandet av ett substrat i kristallerna genom blötläggning och 3D-strukturbestämningen av enzymet: substratkomplex genom en seriell analys av kristaller inuti chipet vid rumstemperatur.
Beredningen av väldriffande kristaller och deras hantering före röntgenanalysen är två kritiska steg i biokristallografiska studier. Vi beskriver ett mångsidigt mikrofluidiskt chip som möjliggör produktion av kristaller med den effektiva metoden för motdiffusion. Den konvektionsfria miljön som tillhandahålls av de mikrofluidiska kanalerna är idealisk för kristalltillväxt och användbar för att sprida ett substrat till det kristallina enzymets aktiva plats. Här tillämpade vi detta tillvägagångssätt på CCA-adderande enzymet av den psykiska bakterien Planococcus halocryophilus i det presenterade exemplet. Efter kristallisering och substrat diffusion/blötläggning bestämdes kristallstrukturen i enzymet: substratkomplexet vid rumstemperatur genom seriell kristallografi och analys av flera kristaller direkt inuti chipet. Hela proceduren bevarar provens äkta diffraktionsegenskaper eftersom det inte kräver någon kristallhantering.
Kristallografi är en metod för att dechiffrera 3D-arkitekturen hos biologiska makromolekyler. Det senare är viktigt för att förstå hur ett enzym väljer och bearbetar sina substrat. Bestämningen av en kristallstruktur kräver kristallisering av målmakromolekylen och kristallens konditionering för deras analys genom röntgendiffraktion1. Både kristallberedning och hantering är avgörande men känsliga steg som kan påverka kristallkvalitet och diffraktionsegenskaper, och därmed upplösningen (dvs. noggrannheten) för den resulterande 3D-strukturen. För att underlätta beredningen av högkvalitativa kristaller och eliminera onödig hantering för att bevara deras diffraktionsegenskaper designade vi en användarvänlig och mångsidig mikrofluidisk enhet som heter ChipX2,3,4.
I den här artikeln kommer vi att visa hur man laddar proteinlösningen i ChipX-kanaler med konventionellt laboratoriematerial för att förbereda kristaller genom motdiffusion. Denna kristalliseringsmetod ger en effektiv screening av övermättnad och av potentiella nukleationsförhållanden längs de mikrofluidiska kanalerna som innehåller enzymlösningen på grund av koncentrationsgradienten som genereras av diffusionen av kristalliserande medel5,6.
Chipinställningen är enkel, den använder bara standard laboratorierör och kräver ingen dyr utrustning. När kristaller har vuxit i ChipX kan enzymens ligands introduceras genom diffusion. Diffraktionsdata samlas sedan in vid rumstemperatur på en serie kristaller som finns i chipens kanaler med hjälp av en synkrotronröntgenkälla. Den strukturella studien som beskrivs här ledde till bestämning av strukturer av en tRNA mognad enzym i sin apo form och i komplex med en analog av dess CTP substrat införs genom blötläggning. Detta protein som kallas CCA-tillsatsande enzym polymeriserar CCA-trinukleotidsvansen i 3′ änden av tRNAs. Jämförelsen av de två 3D-bilderna som erhållits genom seriell kristallografi avslöjar de lokala konformationsändringarna relaterade till bindningen av ligand under förhållanden som är mer fysiologiska än de som används i kryokristallografi. Protokollet som beskrivs i denna video är allmänt tillämpligt på alla biomolekyler, vare sig det är ett protein, en nukleinsyra eller ett multikomponentkomplex.
Nuvarande protokoll inom biokristallografi innebär beredning av kristaller med metoder som ångdiffusion eller sats13,14, och deras överföring till en mikroloop för kryokylning15,16 innan diffraktionsanalysen utförs i en kvävestråle vid kryogena förhållanden. Däremot är direkt kristall cryo-kylning inte möjligt i ChipX3 och kristaller kan inte extraheras från deras mikrofluidiska kanal, vilket kan ses som begränsningar för denna installation. Det protokoll som beskrivs i artikeln ger dock en helt integrerad rörledning för bestämning av kristallstrukturer vid rumstemperatur (dvs. under mer fysiologiska förhållanden). Även om datainsamling vid rumstemperatur orsakar en ökning avstrålningsskador 19, uppvägs denna effekt av snabb datainsamlingstid (högst 60° rotation samlas in på varje kristall) och genom sammanslagning av flera partiella datamängder. Både ChipX design och material optimerades för att minska bakgrundsspridning och diffraktionssignaldämpning3, och datainsamling kan utföras på kristaller med dimensioner motsvarande hälften av kanalerna (40 μm)4.
Sammanfattningsvis är de viktigaste fördelarna med protokollet följande. Kristallerna produceras i en konvektionsfri miljö (mikrofluidiska kanaler), vilket är mycket gynnsamt för tillväxten av högkvalitativa kristaller. Den motdiffusionsmetod som implementeras i ChipX är mycket effektiv vid screening av övermättnadslandskapet; diffusionen av kristallaner i spånkanalen skapar en koncentrations- och övermättnadsvåg som hjälper till att bestämma lämpliga nukleations- och tillväxtförhållanden5. Kristaller hanteras aldrig direkt, men analyseras på plats, inuti chipet, som bevarar deras äkta diffraktionsegenskaper (dvs. förändrar inte kristallmosaik genom fysisk interaktion eller kryokylning)20. Diffraktionsanalysen utförs på en serie kristaller som distribueras längs chipkanalerna med låg dosexponering för att minimera strålningsskador, och en fullständig datauppsättning monteras genom sammanslagning av partiella data från serien. ChipX standardavtryck och enkla design kommer i framtiden att möjliggöra en fullständig automatisering av in situ-datainsamling med hjälp av synkrotron- eller XFEL-anläggningar. Alla steg i protokollet utförs i ChipX. Från experimenterarsynpunkt är spåninställningen enkel och enkel att utföra med standardrör och kräver ingen extra utrustning. Den trädliknande kanalanslutningen vid provinloppet minimerar döda volymer i systemet, vilket är viktigt när du arbetar med prover som är svåra att rena eller som endast är tillgängliga i begränsad mängd.
Sammanfattningsvis förenklar och miniatyriserar lab-on-a-chip-metoden som implementeras i ChipX och miniatyriserar effektivt kristalliseringsprocessen genom kontradiffusion och kristallstrukturbestämning, vilket gör det möjligt att gå från provet till dess 3D-struktur i en enda enhet. Det är allmänt tillämpligt och erbjuder en användarvänlig, kostnadseffektiv lösning för rutinmässiga seriella biokristallografiundersökningar vid rumstemperatur.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner swiss light source (Villigen, Schweiz) för beamtime tilldelning till projektet på beamlines X10SA (PXII) och X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm för hennes bidrag till strukturförfining, Clarissa Worsdale för inspelning av voiceover och François Schnell (Université de Strasbourg) för hans hjälp i videoredigering och SFX. Detta arbete stöddes av det franska centret National de la Recherche Scientifique (CNRS), universitetet i Strasbourg. LabEx-konsortiet “NetRNA” (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), en doktorandfinansiering till R.dW från Excellence-initiativet (IdEx) vid universitetet i Strasbourg inom ramen för det franska nationella programmet “Investissements d’Avenir”, en doktorandfinansiering till K.R. från det fransk-tyska universitetet (UFA-DFH, beviljar nej. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (bidrag nr. Mo 634/10-1). Författarna drog nytta av samarbetsprogrammet PROCOPE Hubert Curien (franska utrikesdepartementet och Deutscher Akademischer Austauschdienst).
Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer – Representative results | |
UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |