Vi præsenterer en protokol til forberedelse af akutte skiver fra musens dorsale mellemliggende hippocampus. Vi sammenligner dette tværgående præparat med korona udskæring med hensyn til kvaliteten af optagelser og bevarelse af morfologiske træk ved registrerede neuroner.
Selvom hippocampus generelle arkitektur er ens langs dens langsgående akse, har nylige undersøgelser afsløret fremtrædende forskelle i molekylære, anatomiske og funktionelle kriterier, der tyder på en opdeling i forskellige underkredsløb langs dens rostro-kaudale omfang. På grund af differentieret konnektivitet og funktion skelnes der mest grundlæggende mellem henholdsvis den dorsale og den ventrale hippocampus, som fortrinsvis er involveret i rumlig og følelsesmæssig behandling. Derfor har in vivo-arbejdet vedrørende rumlig hukommelsesdannelse fokuseret på den dorsale hippocampus.
I modsætning hertil er elektro-fysiologiske in vitro-optagelser fortrinsvis blevet udført på mellemliggende ventral hippocampus, hovedsagelig motiveret af faktorer som skive levedygtighed og kredsløbsintegritet. For at give mulighed for direkte korrelation af in vivo-data om rumlig behandling med in vitro-data har vi tilpasset tidligere sektionsmetoder for at opnå meget levedygtige tværgående hjerneskiver fra den dorsale mellemliggende hippocampus til langsigtede optagelser af hovedceller og internuroner i dentate gyrus. Da rumlig adfærd rutinemæssigt analyseres hos voksne mus, har vi kombineret denne tværgående udskæringsprocedure med brugen af beskyttende løsninger til at forbedre levedygtigheden af hjernevæv fra modne dyr. Vi bruger denne tilgang til mus på ca. 3 måneder. Metoden tilbyder et godt alternativ til koronapræparatet, som ofte bruges til in vitro-undersøgelser af dorsal hippocampus. Vi sammenligner disse to præparater med hensyn til kvaliteten af optagelser og bevarelse af morfologiske træk ved registrerede neuroner.
Hippocampus er blevet undersøgt grundigt for sin centrale rolle i forskellige aspekter af læring og hukommelse, rumlig navigation såvel som følelser. Hippocampus grundlæggende kredsløb, almindeligvis kaldet det “trisynaptiske kredsløb”, er et lamellare netværk i den tværgående akse, som stort set bevares langs længdeaksen1. Hippocampus bidrag til forskellige kognitive og følelsesmæssige adfærd opstår sandsynligvis fra de forskellige forbindelser, som dette grundlæggende kredsløb gør langs dorsoventral aksen med flere andre hjerneregioner2,3. Ud over afferent og sprudlende konnektivitet peger et stigende antal undersøgelser imidlertid i retning af yderligere forskelle langs hippocampus’ septo-tidsmæssige akse. Sådanne forskelle vedrører den interne arkitektur og konnektivitet samt forskelle i genekspressionsmønstre og neuronal morfologi4,5,6,7,8.
I betragtning af eksistensen af sådanne forskelle i det grundlæggende kredsløb er det rimeligt at vælge det specifikke hippocampale underkredsløb, der skal undersøges i henhold til de spørgsmål, der behandles. Hvis spørgsmålet for eksempel vedrører neuronale mekanismer, der er involveret i rumlig behandling, er den dorsale snarere end ventral hippocampus af interesse, selvom de to ikke virker uafhængigt in vivo på grund af intra-hippocampal langsgående forbindelse9,10,11. I den forbindelse skal ikke blot forskellene langs længdeaksen tages i betragtning, men der skal også udvises omhu for at bevare lokale kredsløb og langdistancekredsløb så godt som muligt. For at bevare fiberstierne og konnektiviteten er den vinkel, hvor hjernen vil blive sektionsopdelt, afgørende.
Den første metode rapporteret i litteraturen til at omfatte trysinaptic kredsløb først isoleret hippocampus fra hjernen og derefter lavet tværgående skiver (vinkelret på langsgående akser) ved hjælp af en væv chopper12 og en vibratome13. Senere foretrak fysiologer at få skiver fra en hel hjerneblok for også at bevare de tilstødende hjernestrukturer, der er forbundet med hippocampus. Til disse blokpræparater er der udviklet forskellige sektionsvinkler med hensyn til hippocampus, såsom en korona skiveforberedelse14 eller et vandret skivepræparat ved navn HEC-skive til bevarelse af hippocampal-entorhinal cortex-forbindelser15,16,17.
I sidstnævnte præparat skæres parietalflappen med en vinkel på 0° eller 12° i forhold til det vandrette plan langs rosenkranse-kaudale akse for at danne bunden af blokken. Skiver indsamles derefter fra hjernens ventrale overflade, hvilket hovedsagelig tillader høsten af den mellemliggende ventrale hippocampal region. Denne metode er blevet det mest populære valg til fysiologiske undersøgelser og kan udføres pålideligt efter flere offentliggjorte protokoller18,19,20.
Men hvis forskningsinteressen vedrører specifikke aspekter af rumlig læring, kan den dorsale hippocampus være den mere egnede undersøgelsesregion, og det ville være nyttigt at finde en udskæringsprocedure af lignende kvalitet for denne hippocampale region. Få protokoller, der fokuserer på den meget rostral pol, er blevet udviklet, der kan tilfredsstille denne efterspørgsel 21,22.
I denne protokol beskriver vi i stedet en tilgang til at opnå levedygtige tværgående skiver fra den dorsale mellemliggende hippocampus, der bruger den sektionsvinkel, der tidligere er beskrevet for vandrette præparater18,19 (Figur 1A& B). Vi demonstrerer kvaliteten af denne protokol ved at sammenligne elektrofysiologiske optagelser og morfologiske rekonstruktioner i dette præparat med dem, der opnås i koronaskiver. Denne protokol er især velegnet til kombination med anatomiske og adfærdsmæssige eksperimenter hos voksne mus (tre måneder gamle i vores tilfælde).
Den dorsale hippocampus er blevet grundigt undersøgt for sin rolle i rumlig læring og navigation hovedsageligt gennem adfærdseksperimenter, anatomisk sporing og regionsspecifikke manipulationer. For at kombinere skive-elektro-fysiologiske forespørgsler med disse teknikker, har vi samlet en protokol, der bruger en lignende vinklen på udskæring som den modificerede vandrette udskæring for den mellemliggende ventrale region i hippocampus, men bruger en omvendt udskæring for at opnå tidlige skiver fra det dorsale-mellemliggende område. Denne tilgang reducerer den tid, der kræves for at skære og indsamle den dorsale region hippocampus, hvilket øger skiver levedygtighed.
Ved hjælp af denne metode er vi i stand til rutinemæssigt at hente omkring tre skiver pr. halvkugle af den dorsale hippocampale region mellem 1,4 mm-2,4 mm fra pialoverfladen, som vist i figur 1C. Selv om det ikke er muligt med denne procedure at få tværgående skiver fra hippocampus’ meget septale pol, er det muligt at indsamle omkring to yderligere levedygtige ikke-tværgående skiver pr. halvkugle fra septalstangen (Figur 1C ii,iii). Hvis hippocampus septalpolen er det primære forskningsfokus, kan andre protokoller, der tillader indsamling af tværgående skiver, især fra hippocampus’s meget septale pol, være bedre egnettil 21,32. Adfærdseksperimenter på rumlig navigation og læring udføres fortrinsvis i modne mus med fuldt udviklet neuronal forbindelse. Derfor har vi optimeret vores udskæringsprocedure til anvendelse på hjerner hos voksne dyr (vist her i tre måneder gamle mus), som er mere følsomme over for stress end det modstandsdygtige unge præparat. Til dette formål har vi kombineret flere strategier, der reducerer den hypoksiske stress hjernen udsættes for i tiden mellem ekstraktion og placeringen af skiverne i den iltede ACSF. Den beskyttende skæreopløsning er en NMDG-baseret ACSF25,27,28 med lav Na+ og Ca2+, men høj Mg2+ for at reducere excitotoksisk skade og celle hævelse på grund af aktivering af NMDA-receptorer. Derudover giver HEPES stabil buffering, og forbindelser som ascorbat og pyruvat reducerer oxidativ stress. Den transkortiske perfusion med den kølede og iltede beskyttende skæreløsning drager fordel af det ekstremt tætte kapillærnetværk, der leverer hjernen til hurtigt og homogent at reducere metabolisk efterspørgsel og glutamatinduceret excitotoksicitet i hjernevævet. Efterfølgende udføres næsten alle trin efter halshugning inden for de afkølede og iltede opløsninger for at holde stofskiftet og iltmangel på et minimum under hele proceduren. Andre strategier for at reducere hjerneskade under udskæring eksisterer og kan være lige sågyldige 38. For at demonstrere kvaliteten af vores forberedelse sammenligner vi det med et koronar skivepræparat, som almindeligvis bruges til at registrere fra den dorsale hippocampus. Selvom koronaskiver kan bruges til at opnå god plasterklemmeoptagelse i dentate gyrus, er antallet af usunde og frakoblede neuroner højere end i den tværgående skive. Derudover bevares integriteten af de axonale og dendritiske arborizations bedre i den tværgående skive. Faktisk tjener integriteten af granulatcelleaksler (Figur 3A), der kører ortogonale til hippocampus’ langsgående akse, som en indikator for et tværgående udskæringsplan1.
Til påfyldning af lappede neuroner foreslår vi en elektroderesistens mellem 3 og 5 MΩ. En diameter på spidsen på ca. 1 μm gør det muligt at opnå en god tætningsmodstand under registreringen og god genforsegling ved tilbagetrækning af elektroder. Den mest afgørende detalje er at undgå sugning af dele af soma eller kerne i pipetten. Af denne grund foreslår vi, at du inkluderer et Alexa-farvestof i den intracellulære opløsning, når det er muligt. Farvestoffet gør det muligt at overvåge celleformen under registrering og genforsegling. Desuden giver det mulighed for at vurdere integriteten af den lappede celle efter fiksering, hvilket kan spare immunohistochemistry tid, i tilfælde af mislykkede fyld. På grund af Alexa farvestoffer er slukket med lang fiksering tid, foreslår vi kort fiksering, hvis det er muligt.
Til efterfølgende immunostaining bruger vi en protokol, der ikke kræver omfordeling af skiven. Vi foreslår at gøre farvning inden for en uge efter fiksering. Jo længere skiverne forbliver i køleskabet, jo større er chancen for vævsforringelse. Hvis en lang opbevaring ikke kan undgås, foreslår vi at øge NaN3-koncentrationen i PBS til 0,05% og opdatere den ugentligt. Immunfarvning af hele skiven betyder, at inkubationstiden med primære og sekundære antistoffer øges. Normalt er en natinkubation ved 4 °C nok til at afsløre biocytin, men hvis den kombineres med farvningen for andre proteiner, kan hele farvningsproceduren vare meget længere. Gennemtrængningsblokering og anti-body inkubation skal optimeres individuelt. Normalt, for det primære antistof, to dage er tilstrækkelige, mens en dag kan være nok til den sekundære. Vi anbefaler, at du øger varigheden af vasketrinnene sammen med længere antistofinkubationer for at undgå øget baggrund.
I denne protokol har vi præsenteret en udskæringsmetode for at opnå tværgående eller næsten tværgående hippocampale skiver, der bevarer voksent vævs neuronale levedygtighed og en praktisk tilgang til at genvinde morfologien og den neurokemiske identitet af de lappede neuroner. Denne metode kan let udføres for at matche elektro-fysiologiske resultater med anatomiske og adfærdsmæssige undersøgelser med fokus på den mellemliggende-dorsale del af hippocampus.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kerstin Kronenbitter og Didier Gremelle for teknisk assistance. Vi takker Umberto Morelli for hjælp med grafisk software og Mathias Hoppe for videography og videoredigering. Arbejdet i vores laboratorium blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Projekt-ID 434434223) og GRK2154, Medical Research Council tilskud G1100546/2 og Kiel University.
1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
EGTA | Roth | 3054.1 | |
Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
Large spatula | Roth | E286.1 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
Microfil | World precision instruments | MF34G | |
Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |