Elektroporationsbaseret genetisk modifikation af primære humane pigmentepitelceller ved hjælp af Sleeping Beauty Transposon-systemet

Summary

Vi har udviklet en protokol til at transficere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporation med genet, der koder for pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Vellykket transfektion blev påvist ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).

Abstract

Vores stadig ældre samfund fører til en stigende forekomst af neurodegenerative sygdomme. Indtil videre er de patologiske mekanismer utilstrækkeligt forstået, hvilket hindrer etableringen af definerede behandlinger. Cellebaserede additive genterapier til øget ekspression af en beskyttende faktor betragtes som en lovende mulighed for at medicinere neurodegenerative sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Vi har udviklet en metode til stabil ekspression af den genkodende pigmentepitelafledte faktor (PEDF), der er karakteriseret som et neurobeskyttende og anti-angiogent protein i nervesystemet, ind i genomet af primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler blev isoleret fra humane donorøjne og opretholdt i kultur. Efter at have nået sammenløbet blev 1 x 10⁴ celler suspenderet i 11 μL resuspensionbuffer og kombineret med 2 μL af en oprenset opløsning indeholdende 30 ng hyperaktivt SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposonplasmid. Genetisk modifikation blev udført med et kapillærelektroporationssystem ved hjælp af følgende parametre: to impulser med en spænding på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transinficerede celler blev overført til dyrkningsplader indeholdende medium suppleret med føtalt bovint serum; antibiotika og antimykotika blev tilsat med den første mediumudveksling. Vellykket transfektion blev demonstreret i uafhængigt udførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) viste den øgede ekspression af PEDF-transgenet . PEDF-sekretionen var signifikant forhøjet og forblev stabil, som evalueret ved immunoblotting og kvantificeret ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). SB100X-medieret overførsel muliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet af PE-celler og sikrede kontinuerlig sekretion af PEDF, hvilket er kritisk for udviklingen af en cellebaseret genadditionsterapi til behandling af AMD eller andre retinale degenerative sygdomme. Desuden viste analyse af PEDF-transponens integrationsprofil i humane PE-celler en næsten tilfældig genomisk fordeling.

Introduction

Fremskreden alder beskrives som den største risiko for neurodegenerative sygdomme. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en polygen sygdom, der fører til alvorligt synstab hos patienter over 60 år, hører til de fire mest almindelige årsager til blindhed og synshandicap¹ og forventes at stige til 288 millioner mennesker i 2040². Dysfunktioner af retinal pigmentepitel (RPE), et enkelt lag af tæt pakkede celler placeret mellem choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrager til patogenesen af AMD. RPE udfører flere opgaver, der er afgørende for en normal retinal funktion³ og udskiller en række vækstfaktorer og faktorer, der er afgørende for at opretholde nethindens og choriocapillarisens strukturelle integritet, hvilket understøtter fotoreceptoroverlevelse og giver grundlag for cirkulation og tilførsel af næringsstoffer.

I sunde øjne er pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ansvarlig for at afbalancere virkningerne af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og beskytter neuroner mod apoptose, forhindrer endotelcelleproliferation og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskudt VEGF-til-PEDF-forhold er relateret til okulær neovaskularisering, som blev observeret i dyremodeller ^4,5 såvel som i prøver af patienter med choroidal neovaskularisering (CNV) på grund af AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den øgede VEGF-koncentration er målet for den nuværende standardbehandling. Anti-VEGF-lægemidlerne bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos ca. en tredjedel af CNV-patienterne eller rettere stabiliserer synet i 90% af tilfældene^11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injektioner bærer imidlertid risikoen for bivirkninger¹⁴, forringer patienternes overholdelse og udgør en betydelig økonomisk byrde for sundhedssystemerne¹⁵. Desuden reagerer en vis procentdel af patienterne (2%-20%) ikke eller reagerer kun dårligt på anti-VEGF-behandlingen^16,17,18,19. Disse negative samtidige nødvendiggør udvikling af alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilgange.

Genterapi har udviklet sig som lovende behandling af arvelige og ikke-arvelige sygdomme og har til hensigt at genoprette ikke-funktionelle gensekvenser eller undertrykke funktionsfejl. For polygene sygdomme, hvor identifikation og udskiftning af årsagsfaktorerne næppe er mulig, sigter strategier mod kontinuerlig levering af en beskyttende faktor. I tilfælde af AMD er der udviklet forskellige additive terapier, såsom den stabile ekspression af endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten opløselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1)21,22, den komplementregulerende proteinklynge af differentiering 59 (CD59)²³ eller PEDF ^24,25 . Øjet, og især nethinden, er et glimrende mål for en genbaseret medicin på grund af den lukkede struktur, god tilgængelighed, lille størrelse og immunprivilegium, hvilket muliggør en lokaliseret levering af lave terapeutiske doser og gør transplantationer mindre modtagelige for afvisning. Desuden muliggør øjet ikke-invasiv overvågning, og nethinden kan undersøges ved forskellige billeddannelsesteknikker.

Virale vektorer er på grund af deres høje transduktionseffektivitet det vigtigste middel til at levere terapeutiske gener til målceller. Afhængigt af den anvendte virale vektor er der imidlertid beskrevet forskellige bivirkninger, såsom immun- og inflammatoriske reaktioner²⁶, mutagene og onkogene virkninger ^27,28 eller spredning i andre væv²⁹. Praktiske begrænsninger omfatter en begrænset emballagestørrelse³⁰ samt vanskeligheder og omkostninger forbundet med produktion af kliniske kvalitetspartier^31,32. Disse ulemper har fremmet den videre udvikling af ikke-virale, plasmidbaserede vektorer, der overføres via lipo-/polyplexer, ultralyd eller elektroporation. Imidlertid fremmes genomisk integration af transgenet i værtsgenomet normalt ikke med plasmidvektorer, hvilket resulterer i et forbigående udtryk.

Transposoner er naturligt forekommende DNA-fragmenter, der ændrer deres position inden for genomet, en egenskab, der er blevet vedtaget til genterapi. På grund af en aktiv integrationsmekanisme giver transposonbaserede vektorsystemer mulighed for en kontinuerlig og konstant ekspression af det indsatte transgen. Tornerose (SB) transposon, rekonstitueret fra en gammel Tc1 / mariner-type transposon fundet i fisk³³ og yderligere forbedret ved molekylær evolution, hvilket resulterede i den hyperaktive variant SB100X³⁴, muliggjorde effektiv transponering i forskellige primære celler og blev brugt til fænotypisk korrektion i forskellige sygdomsmodeller³⁵. På nuværende tidspunkt er der indledt 13 kliniske forsøg ved hjælp af SB-transposonsystemet. SB100X transposonsystemet består af to komponenter: transposonen, som omfatter genet af interesse flankeret af terminale inverterede gentagelser (TIR’er), og transposasen, som mobiliserer transposonen. Efter plasmid-DNA-levering til cellerne binder transposasen TIR’erne og katalyserer excisionen og integrationen af transposon i cellens genom.

Vi har udviklet en ikke-viral cellebaseret additiv terapi til behandling af neovaskulær AMD. Fremgangsmåden omfatter den elektroporationsbaserede indsættelse af PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af SB100X-transposonsystemet ^36,37,38. Den genetiske information af transposase og PEDF tilvejebringes på separate plasmider, hvilket muliggør justering af det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforhold. Elektroporation udføres ved hjælp af et pipettebaseret kapillærtransfektionssystem, der er kendetegnet ved en maksimeret mellemrumsstørrelse mellem elektroderne, samtidig med at deres overfladeareal minimeres. Enheden viste sig at opnå fremragende transfekktionshastigheder i en bred vifte af pattedyrceller 39,40,41. Det lille elektrodeoverfladeareal giver et ensartet elektrisk felt og reducerer de forskellige bivirkninger af elektrolyse⁴².

Den anti-angiogene funktionalitet af PEDF udskilt af transinficerede pigmentepitelceller blev vist i forskellige in vitro-eksperimenter, der analyserede spiring, migration og apoptose af humane navlestrengsvenendotelceller⁴³. Derudover viste transplantation af PEDF-transficerede celler i en kaninmodel af hornhinde neovaskularisering⁴⁴ samt en rottemodel af CNV^43,45,46 fald i neovaskularisering.

Her beskriver vi en detaljeret protokol for stabil indsættelse af PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X-transposonsystemet ved hjælp af et kapillærtransfektionssystem. De transinficerede celler blev holdt i kultur i 21 dage og efterfølgende analyseret med hensyn til PEDF-genekspression ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) og med hensyn til PEDF-proteinsekretion ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA, figur 1).

Protocol

Menneskelige donorøjne blev indhentet fra Aachen Cornea Bank ved Afdelingen for Oftalmologi (Universitetshospitalet RWTH Aachen) efter at have indhentet informeret samtykke i overensstemmelse med Helsingforserklæringens protokoller. Procedurerne for indsamling og anvendelse af prøver fra mennesker er blevet godkendt af den institutionelle etiske komité. 1. Isolering af primære humane RPE-celler Læg sterilt beskyttelsestøj og handsker ud. Placer en steril drapering under en lam…

Representative Results

Dyrkning og elektroporation af primære humane RPE-cellerVi har vist, at såning af et tilstrækkeligt antal primære RPE-celler af animalsk oprindelse muliggør dyrkning og vækst til et integreret monolag af pigmenterede, sekskantede celler36,37,48. Deres evne til at danne tætte kryds, udvise fagocytisk aktivitet og udtrykke specifikke markørgener in vitro<sup class="xref…

Discussion

I vores projekt sigter vi mod ikke-viral produktion af genetisk modificerede primære humane RPE-celler, der kontinuerligt overudtrykker og udskiller en effektiv faktor for at bruge de transinficerede celler som langsigtet terapeutisk til etablering og vedligeholdelse af et beskyttende miljø. Vi har etableret introduktionen af genet, der koder for PEDF, et allestedsnærværende udtrykt multifunktionelt protein med anti-angiogene og neurobeskyttende funktioner. Den her beskrevne protokol kan bruges til stabilt og reprodu…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054