Vi har utvecklat ett protokoll för att transfektera primära humana pigmentepitelceller genom elektroporering med genen som kodar för pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Framgångsrik transfektion demonstrerades genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA).
Vårt allt äldre samhälle leder till en växande förekomst av neurodegenerativa sjukdomar. Hittills är de patologiska mekanismerna otillräckligt förstådda, vilket hindrar upprättandet av definierade behandlingar. Cellbaserade additiva genterapier för ökat uttryck av en skyddande faktor anses vara ett lovande alternativ för att medicinera neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Vi har utvecklat en metod för stabilt uttryck av den genkodande pigmentepitel-härledda faktorn (PEDF), som karakteriseras som ett neuroprotektivt och antiangiogent protein i nervsystemet, in i genomet hos primära humana pigmentepitelceller (PE) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Primära PE-celler isolerades från mänskliga donatorögon och upprätthölls i odling. Efter att ha nått sammanflödet suspenderades 1 x 104 celler i 11 μl resuspensionsbuffert och kombinerades med 2 μL av en renad lösning innehållande 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposasplasmid och 470 ng PEDF-transposonplasmid. Genetisk modifiering utfördes med ett kapillärelektroporationssystem med användning av följande parametrar: två pulser med en spänning på 1 100 V och en bredd på 20 ms. Transfekterade celler överfördes till odlingsplattor innehållande medium kompletterat med fetalt bovint serum; Antibiotika och antimykotika tillsattes med det första medieutbytet. Framgångsrik transfektion demonstrerades i självständigt utförda experiment. Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) visade det ökade uttrycket av PEDF-transgenen. PEDF-sekretionen var signifikant förhöjd och förblev stabil, vilket utvärderades genom immunoblotting och kvantifierades med enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). SB100X-medierad överföring möjliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet hos PE-celler och säkerställde kontinuerlig utsöndring av PEDF, vilket är avgörande för utvecklingen av en cellbaserad genadditionsterapi för att behandla AMD eller andra retinala degenerativa sjukdomar. Dessutom indikerade analys av integrationsprofilen för PEDF-transposonen till mänskliga PE-celler en nästan slumpmässig genomisk fördelning.
Hög ålder beskrivs som den största risken för neurodegenerativa sjukdomar. Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), en polygen sjukdom som leder till svår synförlust hos patienter äldre än 60 år, tillhör de fyra vanligaste orsakerna till blindhet och synnedsättning1 och förväntas öka till 288 miljoner människor 20402. Dysfunktioner i retinal pigmentepitel (RPE), ett enda lager av tätt packade celler belägna mellan choriocapillaris och retinala fotoreceptorer, bidrar till patogenesen av AMD. RPE uppfyller flera uppgifter som är väsentliga för en normal retinal funktion3 och utsöndrar en mängd olika tillväxtfaktorer och faktorer som är väsentliga för att upprätthålla den strukturella integriteten hos näthinnan och choriokapillaris, vilket stöder fotoreceptoröverlevnad och ger en grund för cirkulationen och tillförseln av näringsämnen.
I friska ögon är pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) ansvarig för att balansera effekterna av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) och skyddar neuroner mot apoptos, förhindrar endotelcellsproliferation och stabiliserar kapillärendotelet. Ett skiftat VEGF-till-PEDF-förhållande är relaterat till okulär neovaskularisering, vilket observerades i djurmodeller 4,5 samt i prover av patienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grund av AMD och proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den förbättrade VEGF-koncentrationen är målet för den nuvarande standardbehandlingen. Anti-VEGF-läkemedlen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept och senast brolucizumab förbättrar synskärpan hos cirka en tredjedel av CNV-patienterna eller snarare stabiliserar synen i 90% av fallen11,12,13. De frekventa, ofta månatliga, intravitreala injektionerna medför dock risken för biverkningar14, försämrar patienternas efterlevnad och utgör en betydande ekonomisk börda för hälso- och sjukvårdssystemen15. Dessutom svarar en viss andel av patienterna (2%-20%) inte eller reagerar bara dåligt på anti-VEGF-behandlingen16,17,18,19. Dessa negativa samtidiga kräver utveckling av alternativa behandlingar, t.ex. intraokulära implantat, cell- och/eller genterapeutiska metoder.
Genterapi har utvecklats som lovande behandling för ärftliga och icke-ärftliga sjukdomar och avser att återställa icke-funktionella gensekvenser eller undertrycka felaktiga sådana. För polygena sjukdomar, där identifiering och ersättning av orsaksfaktorerna knappast är möjlig, syftar strategierna till kontinuerlig leverans av en skyddande faktor. När det gäller AMD har olika additiva terapier utvecklats, såsom det stabila uttrycket av endostatin och angiostatin 20, VEGF-antagonisten lösligt fms-liknande tyrosinkinas-1 (sFLT-1)21,22, komplementet reglerande proteinkluster av differentiering 59 (CD59)23 eller PEDF 24,25 . Ögat, och särskilt näthinnan, är ett utmärkt mål för en genbaserad medicinering på grund av den slutna strukturen, god tillgänglighet, liten storlek och immunprivilegium, vilket möjliggör en lokal leverans av låga terapeutiska doser och gör transplantationer mindre mottagliga för avstötning. Dessutom möjliggör ögat icke-invasiv övervakning, och näthinnan kan undersökas med olika bildtekniker.
Virala vektorer är, på grund av deras höga transduktionseffektivitet, det viktigaste fordonet för att leverera terapeutiska gener till målceller. Beroende på vilken virusvektor som används har dock olika biverkningar beskrivits, såsom immun- och inflammatoriska svar26, mutagena och onkogena effekter 27,28 eller spridning i andra vävnader29. Praktiska begränsningar inkluderar en begränsad förpackningsstorlek30 samt svårigheter och kostnader i samband med produktionen av partier31,32 av klinisk kvalitet. Dessa nackdelar har främjat den fortsatta utvecklingen av icke-virala, plasmidbaserade vektorer som överförs via lipo-/polyplexer, ultraljud eller elektroporering. Emellertid främjas inte genomisk integration av transgenen i värdgenomet vanligtvis inte med plasmidvektorer, vilket resulterar i ett övergående uttryck.
Transposoner är naturligt förekommande DNA-fragment som ändrar sin position i genomet, en egenskap som har antagits för genterapi. På grund av en aktiv integrationsmekanism möjliggör transposonbaserade vektorsystem ett kontinuerligt och konstant uttryck av den införda transgenen. Törnrosa (SB) transposon, rekonstituerad från en gammal Tc1/mariner-typ transposon som hittades i fisk33 och förbättrades ytterligare genom molekylär evolution vilket resulterade i den hyperaktiva varianten SB100X34, möjliggjorde effektiv transponering i olika primära celler och användes för fenotypisk korrigering i olika sjukdomsmodeller35. För närvarande har 13 kliniska prövningar inletts med hjälp av SB-transposonsystemet. SB100X-transposonsystemet består av två komponenter: transposonen, som består av genen av intresse flankerad av terminala inverterade upprepningar (TIR), och transposaset, som mobiliserar transposonen. Efter plasmid-DNA-leverans till cellerna binder transposaset TIR: erna och katalyserar excisionen och integrationen av transposonen i cellens genom.
Vi har utvecklat en icke-viral cellbaserad additiv terapi för behandling av neovaskulär AMD. Tillvägagångssättet omfattar elektroporationsbaserad införande av PEDF-genen i primära pigmentepitelceller (PE) med hjälp av SB100X-transposonsystemet 36,37,38. Den genetiska informationen om transposas och PEDF tillhandahålls på separata plasmider, vilket möjliggör justering av det ideala SB100X-till-PEDF-transposonförhållandet. Elektroporering utförs med hjälp av ett pipettbaserat kapillärtransfektionssystem som kännetecknas av en maximerad gapstorlek mellan elektroderna samtidigt som deras ytarea minimeras. Enheten visade sig uppnå utmärkta transfektionshastigheter i ett brett spektrum av däggdjursceller 39,40,41. Den lilla elektrodytan ger ett jämnt elektriskt fält och minskar de olika biverkningarna av elektrolys42.
Den anti-angiogena funktionaliteten hos PEDF som utsöndras av transfekterade pigmentepitelceller visades i olika in vitro-experiment som analyserade spridning, migration och apoptos av humana navelvenendotelceller43. Dessutom visade transplantation av PEDF-transfekterade celler i en kaninmodell av hornhinnans neovaskularisering44 samt en råttmodell av CNV43,45,46 nedgång av neovaskularisering.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för stabil insättning av PEDF-genen i primära humana RPE-celler via SB100X-transposonsystemet med hjälp av ett kapillärtransfektionssystem. De transfekterade cellerna hölls i odling i 21 dagar och analyserades därefter med avseende på PEDF-genuttryck genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) och i termer av PEDF-proteinsekretion genom immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA, figur 1).
I vårt projekt strävar vi efter icke-viral produktion av genetiskt modifierade primära humana RPE-celler som kontinuerligt överuttrycker och utsöndrar en effektiv faktor för att kunna använda de transfekterade cellerna som långsiktig terapeutisk för etablering och underhåll av en skyddande miljö. Vi har etablerat introduktionen av genen som kodar för PEDF, ett allestädes närvarande uttryckt multifunktionellt protein med anti-angiogena och neuroprotektiva funktioner. Protokollet som beskrivs här kan använd…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Europeiska unionens sjunde ramprogram för forskning, teknisk utveckling och demonstration, bidragsavtal nr 305134. Zsuzsanna Izsvák finansierades av Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Författarna vill tacka Anna Dobias och Antje Schiefer (Institutionen för oftalmologi, Universitetssjukhuset RWTH Aachen) för utmärkt teknisk support och Aachen Cornea Bank (Institutionen för oftalmologi, Universitetssjukhuset RWTH Aachen) för att ge de mänskliga donatorögonen.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |