Detta protokoll beskriver omvandlingen av huden fibroblaster till myoblaster och deras differentiering till myotubes. Cellinjerna kommer från patienter med neuromuskulära sjukdomar och kan användas för att undersöka patologiska mekanismer och testa terapeutiska strategier.
Undersökningar av både patofysiologi och terapeutiska mål i muskulösa dystrophies har hämmats av den begränsade proliferative kapaciteten hos mänskliga myoblaster. Flera musmodeller har skapats men de representerar antingen inte riktigt sjukdomens mänskliga fysiopatologi eller är inte representativa för det breda spektrumet av mutationer som finns hos människor. Odödlighet av mänskliga primära myoblaster är ett alternativ till denna begränsning; det är dock fortfarande beroende av muskelbiopsier, som är invasiva och inte lätt tillgängliga. Däremot är hudbiopsier lättare att få och mindre invasiva för patienter. Fibroblaster som härrör från hudbiopsier kan förevigas och transdifferentieras till myoblaster, vilket ger en källa till celler med utmärkt myogen potential. Här beskriver vi en snabb och direkt omprogrammeringsmetod för fibroblast till en myogen härstamning. Fibroblaster transduceras med två lentivirus: hTERT för att föreviga den primära kulturen och en tet-inducerbar MYOD, som vid tillsats av doxycyklin inducerar omvandlingen av fibroblaster till myoblaster och sedan mogna myotuber, som uttrycker sena differentieringsmarkörer. Detta snabba transdifferentieringsprotokoll representerar ett kraftfullt verktyg för att undersöka patologiska mekanismer och för att undersöka innovativa genbaserade eller farmakologiska bioterapier för neuromuskulära sjukdomar.
Cellulära modeller som erhålls direkt från mänskliga vävnader är användbara för att modellera många mänskliga genetiska störningar, med fördelen att ha det ursprungliga genomiska sammanhanget och i många fall reproducera samma molekylära och cellulära kännetecken som observerats hos patienterna. Inom området neuromuskulära störningar har muskelbiopsier varit en stor källa till mänskliga myoblaster och har hjälpt till att belysa patologiska mekanismer. Dessutom är de ett viktigt verktyg för in vivo-testning av läkemedel och genterapier. Å ena sidan är härledning av myoblaster från muskelfragment relativt lätt. Å andra sidan är kulturen och underhållet av primära myoblaster utmanande, på grund av deras begränsade spridningshastighet och replikatoriska senescens in vitro1. Ett alternativ för dessa begränsningar är att föreviga myoblaster med införandet av de mänskliga telomeraserna (hTERT) och / eller cyklinberoende kinas 4 (CDK4) gener2,3, med bevarande av skelettmuskulaturfunktioner4. Obtention av primära myoblaster är dock fortfarande beroende av muskelbiopsi, ett kirurgiskt ingrepp med nackdelar för patienterna, som i många fall har sina muskler i avancerad degeneration. Således består muskeln hos dessa patienter av en betydande andel fibrotisk och/eller fettvävnad och ger färre muskelceller, vilket kräver rening av cellerna tidigare till odödlighet.
I motsats till muskelbiopsier är hudbiopsier mer tillgängliga och mindre skadliga för patienter. Primära fibroblaster kan härledas från hudfragment in vitro. Även om fibroblaster inte främst påverkas av mutationer som orsakar neuromuskulära störningar, kan de överföras till myoblaster. Detta kan uppnås genom införandet av Myod-genen, en myogen regulatorisk transkriptionsfaktor5. I detta manuskript beskriver vi protokollet för att erhålla transdifferentierade myoblaster, från upprättandet av fibroblastkulturer till obtention av differentierade myotuber (en representativ sammanfattning av metoden visas i figur 1).
Preklinisk testning av terapeutiska strategier är beroende av cellulära och animaliska modeller som bär mutationer som liknar de mutationer som finns hos mänskliga patienter. Även om utvecklingen av djurmodeller har blivit mer genomförbar med utvecklingen av genredigeringsteknik som CRISPR / Cas96, är det fortfarande utmanande och kostsamt. Således är patientbaserade cellinjer ett tillgängligt alternativ att ha modeller, som täcker det stora spektrumet av mutationer av sjukdomar som Duchennes muskeldystrofi (DMD). Obtention och skapande av cellmodeller är avgörande för utvecklingen av personliga terapier för sådana patologier.
Bland personliga terapier som har undersökts är exon hoppstrategier en av de lovande för olika muskulösa dystroféer7,8. Denna strategi består av att producera ett kortare men funktionellt protein. Detta utförs genom att dölja exondefinitionen för skapliceosomen, vilket utesluter den muterade exon från den slutliga budbäraren. Detta är en mycket lovande teknik som har godkänts av FDA för DMD. Således beskriver vi också i detta protokoll, metoder för att transfect myoblaster med två olika exon hoppa över relaterade tekniker: antisense oligonucleotides (AON) och U7snRNA-adeno-associerade virus (AAV). AON transfection är ett bra verktyg för den första screeningen av flera sekvenser utformade för att främja exon hopparöver 9. AONs verksamhet är dock övergående. För att få ett ihållande uttryck för antisenssekvenser utforskade vi också små kärn-RNAs (snRNAs) i kombination med AAV, vilket möjliggör kärnlokalisering och inkludering i skarvmaskineriet10. U7 är ett snRNA som är involverat i bearbetningen av histon mRNA som kan konstrueras för att binda proteiner som kommer att omdirigera det till skapliceosomen och leverera antisensesekvenser11. Användningen av modifierade U7 snRNAs i kombination med AAV vektorer övervinner begränsningar av AONs vilket resulterar i ett fortsatt uttryck av AONs och bättre transduktion av vävnader av intresse12. Vi använder celler som härrör från DMD patienter för detta protokoll för att illustrera exon-hoppa strategi.
För att få FM-cellinjer med god kvalitet är vissa steg kritiska. Ju tidigare huden biopsi bearbetas, desto större är chansen att få friska fibroblaster. Passagenumret av fibroblastkulturer är också viktigt. Primära celler har begränsad proliferativ kapacitet och efter många passager kommer de in i replikativ senescens. Således är det bättre att ha ett lager av fibroblaster vid ett lågt passagenummer och omvandla celler så snart som möjligt.
Ett annat viktigt steg är också a…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka dr Vincent Mouly för att han tidigare har delat med sig av sin kunskap om modellen. Detta arbete har stötts av US National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., och R.B.W.)), US National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., och N.W.). N.W. har fått stipendiestöd från Ohio State University/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group och Philippe Foundation. Detta arbete stöddes också av interna diskretionära medel och en del av exon 2-hopparbetet har också stötts av CureDuchenne (K.M.F.) och Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 och IBCSC#: IBS00000123.
100 mm dish | Corning | 430167 | |
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
12-well plate | Corning | 3513 | |
20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |