Stegvis cell sådd på tessellerade byggnadsställningar för att studera spirande blodkärl
Summary
Konstruerade vävnader är starkt beroende av lämpliga kärlnätverk för att ge viktiga näringsämnen och gaser och ta bort metaboliskt avfall. I det här arbetet skapar ett stegvis såddprotokoll av endotelceller och stödceller högorganiserade kärlnätverk i en plattform med hög genomströmning för att studera utveckling av fartygsbeteende i en kontrollerad 3D-miljö.
Abstract
Det kardiovaskulära systemet är en nyckelspelare i människans fysiologi, vilket ger näring till de flesta vävnader i kroppen; fartyg finns i olika storlekar, strukturer, fenotyper och prestanda beroende på varje specifik perfused vävnad. Området vävnadsteknik, som syftar till att reparera eller ersätta skadade eller saknade kroppsvävnader, förlitar sig på kontrollerad angiogenes för att skapa en korrekt kärlisering inom de konstruerade vävnaderna. Utan ett kärlsystem kan tjocka konstruerade konstruktioner inte vara tillräckligt närande, vilket kan leda till celldöd, dålig engraftment och i slutändan misslyckande. Således är förståelse och kontroll av beteendet hos konstruerade blodkärl en enastående utmaning på fältet. Detta arbete presenterar ett höggenomströmningssystem som gör det möjligt att skapa organiserade och repeterbara fartygsnätverk för att studera fartygsbeteende i en 3D-byggnadsställningsmiljö. Detta tvåstegs såddprotokoll visar att fartyg inom systemet reagerar på byggnadsställningens topografi och presenterar distinkta spirande beteenden beroende på fackgeometrin där fartygen bor. De erhållna resultaten och förståelsen från detta höga genomströmningssystem kan tillämpas för att informera bättre 3D-bioprintade byggnadsställningar, där tillverkning av olika 3D-geometrier inte snabbt kan bedömas när 3D-utskrift används som grund för cellulära biologiska miljöer. Dessutom kan förståelsen från detta system med hög genomströmning användas för förbättring av snabb läkemedelsscreening, snabb utveckling av samkulturmodeller och undersökning av mekaniska stimuli på blodkärlsbildning för att fördjupa kunskapen om kärlsystemet.
Introduction
Området vävnadsteknik utvecklas snabbt mot tillverkning av konstruerade konstruktioner för att ersätta saknade eller skadade organ ochvävnader 1. Fullt fungerande konstruktioner har dock ännu inte uppnåtts, delvis, eftersom generera operativa vaskulär nätverk för vävnad näring är fortfarande en enastående utmaning. Utan korrekt kärlisering är konstruerade vävnader begränsade till en passiv diffusionstransport av syre och näringsämnen, vilket begränsar den maximala livskraftiga vävnadstjockleken till diffusionsgränsen, cirka 200 μm2. Sådana tjocklekar är inte lämpliga för att reparera stora vävnadsdefekter eller för full organtillverkning, vilket gör närvaron av funktionellt kärlnätverk till en obligatorisk egenskap för funktionella och implanterbaravävnader 3.
Kärlsystemet består av en mängd olika blodkärl, med olika storlekar, fenotyper och organisation, tätt relaterade till värdvävnaden. Att förstå beteende, svar och migrationsbeslut som fattas av utvecklings- och groddkärlen kan instruera deras integration i konstrueradevävnader 4. För närvarande är det vanligaste tillvägagångssättet för att skapa in vitro-kärlnätverk att kombinera endotelceller (ECs) med stödceller (SCs, med förmågan att differentiera till muralceller), sådda inom en tredimensionell mikromiljö. Denna miljö ger kemiska och fysiska signaler så att cellerna kan fästa, föröka sig och självmontera i kärlnätverk2,5,6,7,8. När SCs samkulturerade utsöndrar de extracellulära matrisproteiner (ECM) samtidigt som de ger mekaniskt stöd till ECs, som bildar de rörformiga strukturerna. Dessutom främjar en tvärinteraktion mellan båda celltyperna tubulogenes, kärlgrodd och migration, förutom SCs mognad och differentiering till α-smooth muskelaktin-uttrycker (αSMA) väggmålning celler4. Utveckling av fartygsnät studeras oftast i 3D-miljöer som skapats med hjälp av hydrogeler, porösa polymera byggnadsställningar eller en kombination av dessa. Det senare alternativet ger också en cellvänlig miljö och det mekaniska stöd som krävs för både cellerna och ECM9.
En stor mängd arbete har utförts för att studera vaskulär utveckling, inklusive samodling av cellerna på hydrogeler10,hydrogeler-byggnadsställningarkombinationer 11,12,2D plattformar och mikrofluidiska enheter13. Hydrogeler kan dock enkelt deformeras av de cellpåflytadekrafterna 14, medan 2D- och mikrofluidiksystem misslyckas med att återskapa en närmare naturmiljö för att få ett mer extrapolabeltsvar 15,16. Att förstå hur formande fartyg reagerar på sin omgivning kan ge kritisk insikt som kan möjliggöra tillverkning av konstruerade miljöer med förmågan att styra fartygsutvecklingen på ett förutsägbart sätt. Att förstå kärlbildningsfenomen är särskilt viktigt för att hålla jämna steg med den snabba uppkomsten av submicron-to-micron-skaltillverkningstekniker, såsom stereolitografi, digital projektionslitografi, kontinuerlig produktion av vätskegränssnitt, 3D-smältelektroflektroflykan, lösningsbaserad 3D-elektrostråleskrivning och framväxande bioprintingtekniker17,18,19,20,21. Att anpassa kontrollen av dessa mikrotillverkningstekniker till en fördjupad förståelse av kärlbiologi är nyckeln till skapandet av en lämplig konstruerad vaskulatur för en målvävnad.
Här presenterar vi ett 3D-system för att studera svaret från nya formnings- och groddkärl på den omgivande ställningsgeometrin, observera deras groddursprung och efterföljande migration22. Genom att använda 3D-byggnadsställningar med tessellerade fackgeometrier och en tvåstegsteknik lyckades vi skapa välorganiserade kärlnätverk på ett tydligt och enkelt sätt analyserat. De tessellerade geometrierna ger ett högt genomströmningssystem med enskilda enheter som innehåller fartyg som svarar på deras lokala miljö. Med hjälp av mångfärgade ECs spårade vi groddbildningsursprung och efterföljande migreringsmönster, korrelerade till fackgeometrin och SCs plats22.
Även om det föreslagna protokollet har förberetts för att analysera effekterna av geometriska signaler på vascularization beteende, kan denna metod utökas och tillämpas på en mängd nya applikationer. Den tessellerade byggnadsställningen och de lätt bildbara nätverken möjliggör enkel analys av olika ECs och SCs interaktion, tillägg av specifika organceller och deras interaktion med vaskulär nätverk, läkemedelseffekt på vaskulär nätverk och mer. Vårt föreslagna system resulterar mycket mångsidigt och av enkel tillverkning och bearbetning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behovet av en rik vaskulatur inuti inbäddad i konstruerade vävnader är avgörande för konstruktionsöverlevnad och korrekt funktion1. Även om ingenjörskonsten i kärlsystemet har varit i fokus för en stor mängd forskning, återstår mycket att undersöka och förstå24. I synnerhet, när man återskapar en specifik vävnad, bör mikrovaskulaturen bete sig och organisera i enlighet därmed12. Det vanligaste tillvägagångssättet för mikroves…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av finansiering från University of Michigan – Israel Partnership for Research. Författarna vill tacka Uri Merdler, Lior Debbi och Galia Ben David för deras stora hjälp och stöd, Nadine Wang, Ph.D. och Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. vid Lurie Nanofabrication Facility vid University of Michigan, samt Luis Solorio, Ph.D. för upplysande diskussioner om fotolitografitekniker.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
Riferimenti
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioingegneria. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -. H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
