सभी पशु प्रयोगों के मानकों और कैंटोनल नैतिकता आयोग ज्यूरिख और आणविक स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान, ईटीएच ज्यूरिख में महाकाव्य पशु सुविधा के नियमों के अनुसार लाइसेंस ZH152/17 के तहत किया गया । नोट: यह प्रोटोकॉल H19के हटाने के साथ शुरू होता है – और आईजी-PHAESCs में DMRs। PHAESC लाइनों को स्थापित करने के बारे में विवरण के लिए, कृपया प्रकाशित रिपोर्ट10,13का उल्लेख करें । चित्रा 1एमें इस प्रोटोकॉल (चरण 1-14) का अवलोकन और समय सीमा प्रदान की गई है; मीडिया, समाधान और बफ़र्स टेबल 1में सूचीबद्ध हैं । DKO-PHAESC लाइनों (चरण 1-6) स्थापित करने की प्रक्रिया चित्रा 1Bमें दिखाया गया है, और अर्ध-क्लोन भ्रूण (चरण 7-14) के निर्माण की रणनीति को चित्रित किया गया है चित्र 1Cमें। 1. एच19को हटाने के लिए प्लाज्मिड का ट्रांसफेक्शन- पीएचईसी में डीएमआर और आईजी-डीएमआर Cas9 नाभिकों की सह-अभिव्यक्ति के लिए CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड तैयार करें और H19-DMRऔर IG-DMRके विलोपन को लक्षित करने के लिए आरएनए का मार्गदर्शन करें । लिगेट गाइड आरएनए ओलिगोस के चार जोड़े (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, आर; आईजी-डीएमआर-gRNA1-F, आर; आईजी-डीएमआर-जीआरए 2-एफ, आर टेबल 2में सूचीबद्ध) pX330 प्लाज्मिड्स में।नोट: इन 4 CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड्स14की तैयारी के लिए विस्तृत प्रक्रिया पर प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख करें । वैकल्पिक रूप से, सामान्य माउस उपभेदों के लिए उपलब्ध प्लाज्मिड भी एक भंडार(सामग्री की तालिका) केमाध्यम से सुलभ हैं। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करके 0.2% जिलेटिन समाधान के 1 मिलील के साथ 6-अच्छी प्लेट के एक कुएं की सतह को कोट करें। प्लेट 2 × 105 वाइल्डटाइप phaESCs जिलेटिन पर लेपित अच्छी तरह से एंटीबायोटिक दवाओं के बिना haESC माध्यम में अच्छी तरह से, और 1 दिन के लिए एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट ।नोट: एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से छोड़ दिया जाता है बाद lipofection की दक्षता में वृद्धि हुई है । हमने 10 मार्ग पर वाइल्डटाइप फेजसी का उपयोग किया। हम प्रारंभिक मार्ग phaESCs का उपयोग करने की सलाह देते हैं, लेकिन विभिन्न प्रकार के मार्ग संख्या का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है8। अंश संख्या और अर्द्ध क्लोन भ्रूण और चूहों को प्राप्त करने की दक्षता के बीच संबंध वर्तमान में ज्ञात नहीं है । एक 6-अच्छी प्लेट के कुएं में phaESCs ट्रांसफेक्ट (चरण 1.3 से) 6 प्लाज्मिड के साथ एक साथ लिपोफेक्शन रीएजेंट का उपयोग कर: 50 एनजी पिग्गीबेक प्लाज्मिड एक सीएजी-ईजीएफपी ट्रांसजीन ले जा रहा है, 50 एनजी पिग्गीबाक ट्रांसपोसेस प्लाज्मिड, और 4 CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड (चरण 1.1 से) में से प्रत्येक के 600 एनजी। ट्रांसफैक्शन की विस्तृत प्रक्रिया पर निर्माता के प्रोटोकॉल को देखें।नोट: दो पिग्गीबेक प्लाज्मिड का उपयोग एफईएससी के जीनोम में उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के लिए ट्रांसपोसन को एकीकृत करने के लिए किया जाता है। यदि कोशिकाओं के जीएफपी अंकन की आवश्यकता नहीं है, तो इन दो प्लाज्मिड को फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जैसे, pX458 प्लाज्मिड) की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए एक CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, बजाय PX330 प्लाज्मिड में से एक । क्षणिक ईजीएफपी अभिव्यक्ति का उपयोग संक्रमित कोशिकाओं को छांटने के लिए किया जा सकता है। ट्रांसफैक्शन के दो दिन बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें, और ट्राइपसिन के 800 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। फिर, ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए वॉश बफर के 2 एमएल जोड़ें, और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट करें। सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें, और सुपरनेट को हटा दें। 15 माइक्रोन/एमएल होचस्ट 33342 के साथ सप्लीमेंट वाले एचईएससी मेंटेनेंस बफर के 400 माइक्रोन में सेल पेलेट को रीसुस्ट करें।नोट: Hoechst ३३३४२ की संभावित विषाक्तता को कम करने के लिए, 1 μg/mL Hoechst ३३३४२ और ५० μM verapamil के बजाय 15 μg/mL Hoechst ३३३४२15का इस्तेमाल किया गया है । 15 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, सेल स्ट्रींगर कैप के माध्यम से सेल सस्पेंशन को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और अगले चरण (धारा 2) में उपयोग करने के लिए तैयार होने तक ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 2. एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर संक्रमित phaESCs के एकल सेल चढ़ाना एक दिन संक्रमित phaESCs छंटाई से पहले, प्लेट विकिरणित माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (MEFs) जिलेटिन पर लेपित ९६-अच्छी प्लेटों 4 × १०४ कोशिकाओं/सीएम2 के घनत्व पर MEF माध्यम में । आमतौर पर, 6 प्लेटें लक्षित विलोपन के साथ एक PHAESC लाइन स्थापित करने के लिए तैयार हैं। 5% सीओ2 वातावरण में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।नोट: विकिरणित एमईएफ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हम DR4 चूहों के E12.5 भ्रूण से प्राप्त MEFs का उपयोग करें। हालांकि एचईएससी एमईएफ के बिना जिलेटिन-लेपित प्लेटों पर बढ़ सकता है, हम सॉर्ट किए गए एकल एचईएससी की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए एमईएफ की सलाह देते हैं। छंटाई के दिन, 96-अच्छी प्लेटों से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें, और प्रति अच्छी तरह से ताजा एचईएससी माध्यम के 120 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार 100 माइक्रोन नोजल के साथ एक सेल सॉर्टर स्थापित करें। एक 355 एनएम यूवी लेजर और एक 488 एनएम ब्लू लेजर क्रमशः Hoechst 33342 और EGFP फ्लोरेसेंस के उत्तेजन के लिए उपयोग किया जाता है।नोट: वैकल्पिक रूप से, Hoechst 33342 405 एनएम के साथ उत्तेजन द्वारा पता लगाया जा सकता है। जी 1/एस चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक गेट का उपयोग करके 5 एमएल ट्यूब (चरण 1.10 से) में संक्रमित phaESCs को सॉर्ट करें जो ईजीएफपी अभिव्यक्ति दिखाता है। चरण 2.2 से 96-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में एक सेल जमा करें।नोट: Hoechst ३३३४२ धुंधला का पता लगाने आम तौर पर एक 1n, 2n, और 4n डीएनए सामग्री है, जो G1 चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं के अनुरूप के साथ कोशिकाओं की 3 चोटियों अलग, G2/M चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं का मिश्रण है और G1 चरण में diploid कोशिकाओं, और G2/M चरण में diploid कोशिकाओं, क्रमशः । जी1/एस चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को होचस्ट 33342 फ्लोरेसेंस की कम तीव्रता वाले शिखर के रूप में पहचाना जाता है। एक प्रतिनिधि परिणाम और एक छंटाई गेट चित्रा 2Aमें दिखाया गया है । चढ़ाना के बाद, 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेटों को इनक्यूबेट करें। 3. संक्रमित phaESCs की उप क्लोनिंग एकल सेल चढ़ाना के तीन दिन बाद, एक माइक्रोस्कोप के नीचे ९६-अच्छी प्लेटों के कई कुओं में कालोनियों को देखा जा सकता है । जिन कुओं में केवल एक ही कॉलोनियां उगती हैं, उन्हें चिह्नित करें।नोट: हमारे अनुभव में, एकल कालोनियों 96-अच्छी प्लेटों के कुओं के 20%-40% में देखा गया था। एकल सेल चढ़ाना के बाद 4 दिन पर, एकल कालोनियों के साथ कुओं में नए haESC माध्यम के साथ माध्यम के आधे की जगह । पासिंग से एक दिन पहले (सिंगल सेल प्लेटिंग के बाद 4 या 5 दिन में), प्लेट ने एमईएफ माध्यम में 4 × 104 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर जिलेटिन-लेपित ९६-वेल प्लेटों पर एमईएफ को विकिरणित किया । प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एकल सेल चढ़ाना के 5 या 6 दिनों के बाद, 150 माइक्रोन से बड़ा व्यास के साथ एकल कालोनियों युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं का चयन करें।नोट: लगभग 100 कुओं को लक्षित डीएमआर विलोपन के साथ एक PHAESC लाइन स्थापित करने के लिए अधिमानतः चुना जाता है। चयनित कुओं में माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइपसिन के 30 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें। फिर, ट्रिप्पसिन को बुझाने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 30 माइक्रोन वॉश बफर जोड़ें। प्रत्येक कुएं में 140 μL haESC माध्यम जोड़ें, और एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट करें। चरण 3.3 में तैयार 96-अच्छी प्लेटों के कुओं से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें। चरण 3.6 से प्रत्येक अच्छी तरह से PHAESCs को चरण 3.7 से नए 96-अच्छी प्लेट के एक ताजा कुएं में स्थानांतरित करें। 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर phaESC उपकक्षित 96-अच्छीप्लेटों को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, प्रत्येक कुएं से सभी माध्यमों को एस्पिरेट करें, और नए एचईएससी माध्यम के 120 माइक्रोन जोड़ें। 5% सीओ2 वातावरण में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक दिन पहले कोशिकाओं passaging के लिए ढुलमुल हो जाते हैं, जिलेटिन पर विकिरणित MEFs प्लेट-लेपित 24-अच्छी प्लेटों 4 × 104 कोशिकाओं/एमईएफ माध्यम में सेमी2 के घनत्व पर । प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। जब phaESCs पासेजिंग के लिए संकुचित हो गए हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइपसिन के 30 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें। ट्राइप्सिन को बुझाने के लिए प्रत्येक कुएं में 90 माइक्रोन वॉश बफर जोड़ें। एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट। चरण 3.11 से 24-अच्छी प्लेटों के कुओं से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें, और ताजा एचईएससी माध्यम के 600 माइक्रोन जोड़ें। चरण 3.13 में प्रत्येक कुएं से PHAESC उपकक्षानों के निलंबन के 60 μL को चरण 3.14 से 24-अच्छी प्लेटों के एक नए कुएं में स्थानांतरित करें। डीएनए निष्कर्षण और चरण 4 में जेनोटीपिंग के लिए प्रत्येक PHAESC उपक्लोन के शेष निलंबन रखें । 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर PHAESC उपकक्षों के साथ24 अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें। एक दिन पहले सेल संस्कृतियों passaging के लिए घनत्व तक पहुंचने, जिलेटिन पर विकिरणित MEFs प्लेट-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों 4 × 104 कोशिकाओं/एमईएफ माध्यम में सेमी2 के घनत्व पर । प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। जब phaESCs पासेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से संकुचित हो जाते हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और 250 माइक्रोन ट्राइपसिन जोड़ें। 24-अच्छी प्लेटों को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।नोट: चरण 4.9 में जीनोटाइपिंग के बाद, एच19-डीएमआर और आईजी-डीएमआर दोनों को हटाने के साथ केवल phaESC लाइनों को पारित करने की आवश्यकता है। ट्रिपसिन को बुझाने के लिए प्रत्येक कुएं में 750 μL वॉश बफर जोड़ें। एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट। सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनैंट को हटा दें, और एचईएससी माध्यम के 2 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। चरण 3.17 से 6-अच्छी प्लेटों के कुओं से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें। प्रत्येक ट्यूब से फेजसी निलंबन को चरण 3.20 से एक नए कुएं में स्थानांतरित करें। प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 3.17 से 3.21 चरणों को दोहराकर सेल क्लोन का विस्तार करें और प्लेट के आकार और ट्राइप्सिन, वॉश बफर और एचईएससी माध्यम की मात्रा बढ़ाएं। चरण 5 के लिए एमईएफ की प्रत्येक उप-क्लोन phaESC लाइन के लिए एक टी-25 फ्लास्क तैयार करें।नोट: हम प्रत्येक उप-क्लोन phaESC लाइन के एक aliquot ठंड माध्यम के ३०० μL में और 5 कदम करने के लिए आगे बढ़ने से पहले तरल नाइट्रोजन भंडारण में एक क्रायोस्टॉक रखने की सलाह देते हैं । 4. एमईएफ के साथ उप-क्लोन phaESC लाइनों की पहली जेनोटाइपिंग चरण 3.15 से शेष सेल निलंबन से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, 96-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में लाइसिस बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। सेल निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें। शेष सभी कोशिकाओं को ठीक करने और एक ही 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए लाइसिस बफर के अतिरिक्त 200 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला। मिश्रण के साथ 3 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलील ट्यूब इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में आइसोप्रोपेनॉल के 460 माइक्रोन जोड़ें, और धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि डीएनए तेज़ी दिखाई न दे। 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट को हटा दें। डीएनए छर्रों को 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन से धोएं। 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट को हटा दें। ट्यूबों को 10 मिनट तक हवा में सुखाएं और फिर डीएनए को 20 माइक्रोन पानी में रिसिपेंड करें। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करके पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें।नोट: पीसीआर के लिए प्राइमर जोड़े तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं और इस प्रकार उपयोग किए जाते हैं: एच 19-डीएमआर-पी 1 और पी 3 (हटाए गए एच 19-डीएमआर के लिए 407 बीपी); H19-DMR-P2 और P3 (वाइल्डटाइप H19-DMRके लिए ६२३ बीपी); आईजी-डीएमआर-पी 1 और पी 3 (हटाए गए आईजी-डीएमआरके लिए 319 बीपी); आईजी-डीएमआर-पी 2 और पी 3 (वाइल्डटाइप आईजी-डीएमआरके लिए ४९२ बीपी) । सभी प्राइमर जोड़े के लिए पीसीआर का तापमान प्रोफाइल इस प्रकार है- 30 एस 98 डिग्री सेल्सियस, 35 एक्स (10 एस 98 डिग्री सेल्सियस, 20 एस 56 डिग्री सेल्सियस, 30 एस 72 डिग्री सेल्सियस), 5 मिनट 72 डिग्री सेल्सियस। H19-DMRऔर IG-DMRविलोपन के लिए प्रवर्धित डीएनए टुकड़ों की लंबाई CRISPR/Cas9-मध्यस्थता संपादन से जुड़े गैर-अनुरूप अंत के कारण कुछ भिन्नता दर्शाती है । PhaESCs MEFs के साथ सुसंस्कृत थे, जिसमें वाइल्डटाइप H19-DMRऔर IG-DMRडीएनए होते हैं । इसलिए, H19-DMR-P2/P3 और आईजी-DMR-P2/P3,जो वाइल्डटाइप डीएनए टुकड़ों को बढ़ाना के प्राइमर जोड़े, जानकारीपूर्ण नहीं हैं । हालांकि, इन प्राइमर जोड़े को नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाता है और सभी प्रतिक्रियाओं में एक बैंड देना चाहिए। एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीसीआर के टुकड़ों का विश्लेषण करें। इलेक्ट्रोफोरेसिस16की विस्तृत प्रक्रिया पर प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख करें । दोनों H19-DMRऔर आईजी-DMR के विलोपन के साथ सेल लाइनों कीपहचान करें । इलेक्ट्रोफोरेसिस की एक प्रतिनिधि छवि चित्र 2बीमें दिखाई गई है।नोट: हमारे मामले में, 135 उप-क्लोनphaESC लाइनों के बीच एच 19-डीएमआर और आईजी-डीएमआर दोनों के विलोपन के साथ आठ सेल लाइनों की पहचान की गई थी। 5. उप-क्लोन phaESC लाइनों का हैप्लॉयड सेल शुद्धिकरण जब चरण 3.22 से टी-25 फ्लास्क में उप-क्लोन phaESC संस्कृतियां पासिंग के लिए पर्याप्त घने हो जाती हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइप्सिन के 1.5 मिलियन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। फिर, सिंगल-सेल सस्पेंशन प्राप्त करने के लिए कई बार वॉश बफर और पिपेट के 4.5 एमएल जोड़ें। प्रत्येक कोशिका निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट निकालें और 15 μg/mL Hoechst 33342 के साथ पूरक haESC रखरखाव बफर के 400 माइक्रोन में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, सेल स्ट्रींगर कैप के माध्यम से सेल सस्पेंशन को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। एचईएससी रखरखाव बफर के अतिरिक्त 400 माइक्रोन के साथ सेल छन्नी टोपी कुल्ला, और एक ही 5 एमएल ट्यूब में शेष कोशिकाओं को इकट्ठा। ट्यूब को सॉर्ट करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार 100 माइक्रोन नोजल के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर सेट करें।नोट: Hoechst 33342 405 एनएम पर उत्तेजन द्वारा पता लगाया जा सकता है। यहां होचस्ट 33342 का पता लगाने के लिए 355 एनएम यूवी लेजर का इस्तेमाल किया जाता है। सेल निलंबन (चरण 5.3 से) और प्रवाह साइटोमीटर में सॉर्ट्ड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 2 एमएल एचईएससी रखरखाव बफर युक्त एक नई 15 एमएल ट्यूब सेट करें। विश्लेषण शुरू करें और G1/S चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए छंटाई गेट स्थापित करें। G1/S चरण phaESC आबादी की पहचान करने के लिए चित्रा 2A में हिस्टोग्राम का उल्लेख करें ।नोट: कुछ उप-क्लोन phaESC लाइनों में किसी भी हैप्लॉयड कोशिकाओं को शामिल नहीं किया जा सकता है क्योंकि पूर्ण द्विविवाह या कदम 2 में डिप्लॉयड कोशिकाओं की गलत चढ़ाना । यदि जी1/एस चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को नहीं देखा जाता है, तो छंटाई के बिना दूसरे नमूने में आगे बढ़ें। हमारे मामले में, 5 सेल लाइनों में हैप्लॉयड कोशिकाएं थीं और 3 सेल लाइनों में 8 उप-क्लोन phaESC लाइनों में से केवल डिप्लॉयड कोशिकाएं थीं। सेल छंटाई के बाद, 15 एमएल संग्रह ट्यूब की दीवार के साथ वॉश बफर के 5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें। सुपरनिट निकालें। छंटाई कोशिकाओं की संख्या के आधार पर खेती के लिए उपयुक्त आकार की एक थाली का चयन करें। एक 96-अच्छी प्लेट, एक 24-अच्छी प्लेट, और संस्कृति के लिए 12-अच्छी प्लेट का उपयोग करें 1,000-40,000 कोशिकाएं, 40,000-200,000 कोशिकाएं, और 200,000-40000 कोशिकाएं, क्रमशः। सेल पेलेट को क्रमशः 120 माइक्रोल, 600 माइक्रोल और 1.2 एमएल एचईएससी माध्यम में रीसुस्पेंड करें।नोट: उच्च घनत्व पर कोशिकाओं की थाली क्योंकि कम संगम छंटाई के बाद कोशिकाओं की कोशिकाओं की मौत का कारण बन सकता है । इस बिंदु के बाद से, चरण 6 में जीनोटाइपिंग और स्टेप 9 से इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए बाद के आवेदन की सुविधा के लिए एमईएफ के बिना जिलेटिन-लेपित कुओं पर PHAESCs को सुसंस्कृत किया जाता है। कोशिका निलंबन को उचित आकार के जिलेटिन-लेपित कुएं में स्थानांतरित करने के बाद, प्लेट को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्लेट आकार बढ़ाने और ट्राइप्सिन, वॉश बफर और एचईएससी माध्यम की मात्रा में वृद्धि के साथ कदम 3.18 से 3.21 तक दोहराकर PHAESC संस्कृतियों का विस्तार जारी रखें। कोशिकाओं को एमईएफ के बिना जिलेटिन-लेपित कुओं पर सुसंस्कृत किया जाता है। प्रत्येक उप क्लोन PHAESC लाइन के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से और एक अच्छी तरह से कदम 6 और 9 के लिए एक अच्छी तरह से तैयार करते हैं, क्रमशः ।नोट: प्रत्येक उप-क्लोन phaESC लाइन की कुछ कोशिकाओं को 9 कदम आगे बढ़ने से पहले एक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक में क्रायोस्टॉक के रूप में ठंड माध्यम के ३०० μL में जमे हुए होना चाहिए । 6. एमईएफ के बिना उप-क्लोन phaESC लाइनों की दूसरी जेनोटीपिंग नोट: जेनोटीपिंग का दूसरा दौर इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि उप-क्लोन phaESC लाइनों में एच 19-और आईजी-डीएमआरएसदोनों के विलोपन हैं, और एमईएफ को हटाने के बाद वाइल्डटाइप एलील्स अनुपस्थित हैं। माइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि करें कि कदम 5.11 से 24-अच्छी प्लेटों के कुओं में संस्कृतियों MEFs से मुक्त हैं।नोट: यदि MEFs मनाया जाता है, तो संस्कृतियों को तब तक पास करना जारी रखना आवश्यक है जब तक कि एमईएफ एमईएफ से वाइल्डटाइप डीएनए के साथ पीसीआर को दूषित करने से बचने के लिए गायब न हो जाएं। संकुचित संस्कृतियों से माध्यम को आकांक्षी और 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से लाइसिस बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें। कई बार पाइपिंग करने के बाद, सेल सस्पेंशन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। मिश्रण के साथ 3 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलील ट्यूब इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, 1.5 एमएल ट्यूब में आइसोप्रोपेनॉल के 400 माइक्रोन जोड़ें, और धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि डीएनए तेज़ी दिखाई न दे। 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। डीएनए गोली को 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन से धोएं। 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। ट्यूब को 10 मिनट तक हवा में सुखाएं और फिर डीएनए को 50 माइक्रोन पानी में रीसेल करें। सेल लाइनों की पहचान करने के लिए चरण 4.7 और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद जेनोटीपिंग पीसीआर करें, जिसमें एच19- और आईजी-डीएमआरएसदोनों के विलोपन हैं और वाइल्डटाइप एलील्स से मुक्त हैं।नोट: संदर्भ के लिए चित्र 2बी में एक विशिष्ट दूसरी जीनोटाइपिंग विश्लेषण की एक छवि दिखाई गई है। हमारे मामले में, हैप्लॉयड सेल शुद्धिकरण (चरण 5) के बाद चयनित सभी 5 सेल लाइनें वाइल्डटाइप एलील्स से मुक्त थीं और इसमें एच19के केवल विलोपन एलील्स थे – और आईजी-डीएमआरएस। DKO-phaESC लाइनों के रूप में इस दूसरी जीनोटाइपिंग के बाद चयनित उप-क्लोन phaESC लाइनों का उपयोग करें। 7. चूहों का सुपरओव्यूलेशन एमआईआई ओसाइट्स के उत्पादन के लिए, ऊसाइट संग्रह से पहले प्रत्येक B6D2F1 महिला माउस (4-5 सप्ताह पुराना) 63-65 घंटे में गर्भवती घोड़ी सीरम गोंडोट्रोपिन (पीएमएसजी) समाधान के 5 आईयू के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा सुपरओव्यूलेशन शुरू करें।नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए B6D2F1 माउस तनाव की सिफारिश की जाती है क्योंकि B6D2F1 oocytes इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन को अच्छी तरह से सहन करता है और प्रक्रिया17के बाद उच्च विकासात्मक क्षमता दिखाता है। पीएमएसजी इंजेक्शन के 48 घंटे बाद, इंट्रापेरिटोनली प्रत्येक माउस में मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन समाधान के 5 आईयू इंजेक्ट करें। 8. ऊसाइट संग्रह एक अच्छी तरह से 700 माइक्रोनल हाइलुरोनिडेस माध्यम और शेष 3 कुओं में एम2 माध्यम के 700 माइक्रोन युक्त 4-अच्छी प्लेट तैयार करें। इसके अतिरिक्त, M2 माध्यम के 7 एमएल के साथ एक 6-सेमी डिश और M16 माध्यम के 900 माइक्रोन के साथ एक केंद्र-अच्छी डिश तैयार करें। 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट और व्यंजन को पहले से गर्म करें। इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के दिन, सुबह लगभग 8 बजे सर्वाइकल अपभ्रंश या सीओ 2 साँस लेना द्वारा सुपरोव्यूलित महिलाओं (चरण7.2 से) को इच्छामृत्यु दें। चिमटी और कैंची का उपयोग करके अंडाशय को विच्छेदन करें। ओविक्ट्स को एम2 मीडियम के साथ 6 सेमी डिश में रखें। 30 जी सुई के साथ ओविडक्ट्स के एम्पुला को फाड़कर क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों (सीओसी) को छोड़ दें। सीओसी को प्री-गर्म हाइलुरोनिडेज माध्यम में स्थानांतरित करें और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 2-3 मिनट के बाद, एक मुंह पिपेट के साथ क्यूमुलस-मुक्त ओसाइट्स एकत्र करें और 4-वेल प्लेट के अन्य 3 कुओं में ताजा एम 2 माध्यम में स्थानांतरित करके ऊसाइट्स को 3 बार धोएं। मेटाफेज़ II (एमआईआई) ओसाइट्स को इकट्ठा करें, जिसके पास पहले ध्रुवीय निकाय हैं, एम 16 माध्यम के साथ एक केंद्र-अच्छी डिश में और प्लेट को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि चरण 12 में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए उपयोग न हो जाए। 9. DKO-PHAESCs का उपचार और संग्रह इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन (चरण 5.11 से) से एक दिन पहले 60-80% कन्फ्लरी पर एमईएफ के बिना 6-अच्छी प्लेट के कुएं में एक DKO-phaESC संस्कृति तैयार करें। एम-चरण में सेल चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करने के लिए, माध्यम को पूरी तरह से एस्पिरेट करें और 0.05 मिलीग्राम/एमएल डेमेकोल्सिन युक्त एचईएससी माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। डेमेकोल्सिन उपचार के 8 घंटे के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइपसिन के 800 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें, फिर ट्राइप्सिन को बुझाने के लिए 2 मिलियन वॉश बफर जोड़ें, और एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट करें। सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। 15 माइक्रोग्राम/एमएल होचस्ट 33342 वाले एचईएससी रखरखाव बफर के 400 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें। 15 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, सेल सस्पेंशन को सेल छन्नी टोपी के माध्यम से 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और चरण 10 में सेल छंटाई तक ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 10. एम-फेज-गिरफ्तार DKO-PHAESCs का शुद्धिकरण निर्माता के निर्देशों के अनुसार 100 माइक्रोन नोजल के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर सेट करें।नोट: Hoechst 33342 405 एनएम पर उत्तेजन द्वारा पता लगाया जा सकता है। यहां होचस्ट 33342 का पता लगाने के लिए 355 एनएम यूवी लेजर का इस्तेमाल किया जाता है। एम-चरण-गिरफ्तार DKO-PHAESCs कदम 9.7 से स्थापित करें और विश्लेषण शुरू करें। डेमेकोल्सिन के साथ इलाज किए गए नमूने से हैप्लॉयड एम-फेज कोशिकाओं (2n) को इकट्ठा करने के लिए एक उपयुक्त छंटाई गेट का चयन करें।नोट: डेमेकोल्सिन उपचार के बाद, 2 सेल आबादी की उम्मीद की जाती है, जो हैप्लॉयड और डिप्लॉयड एम-फेज-गिरफ्तार कोशिकाओं के अनुरूप है जैसा कि चित्र 3बीमें दिखाया गया है । डेमेकोसिन उपचार के बाद सेल चक्र गिरफ्तारी पूरी हो गई है, इस प्रकार, कोई हैप्लॉयड 1n डीएनए चोटी नहीं देखी जाती है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि हैप्लॉयड एम-फेज कोशिकाओं और डिप्लॉयड जी1 कोशिकाओं के पास एक ही डीएनए सामग्री (2n) है और ओवरलैपिंग चोटियों का उत्पादन होगा। प्रवाह साइटोमीटर में सॉर्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 2 एमएल एचईएससी रखरखाव बफर युक्त 15 एमएल ट्यूब सेट करें। सेल छंटाई शुरू करें। सेल छंटाई के बाद, संग्रह ट्यूब की दीवार के साथ वॉश बफर के 5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एचईएससी रखरखाव बफर की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। सेल निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 12 चरण में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए तैयार होने तक बर्फ पर ट्यूब रखें। 11. होल्डिंग और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की तैयारी नोट: इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन (चरण 12) करने के लिए, कई होल्डिंग और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट(चित्रा 4A)की आवश्यकता होती है। इन पिपेट को एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से दर्जी की मांग पर खरीदा जा सकता है या माइक्रोपिपेट पुलर और माइक्रोफॉर्ज का उपयोग करके उपयुक्त ग्लास केशिकाओं से बनाया जा सकता है। माइक्रोपिपेट पुलर पर बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाएं खींचें। फिलामेंट (0.78 x 1.00 x 80 मिमी) के बिना बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं को खींचने के लिए निम्नलिखित पैरामीटर एक ज्वलंत क्षैतिज खींचने के लिए दिए जाते हैं(सामग्री की तालिका)संदर्भ के रूप में, लेकिन अन्य उपकरणों और ग्लास केशिका प्रकारों के लिए अलग होगा: हीट 510 (रैंप टेस्ट 480), पुल 0, वेग 150, समय 175 और पिपेट रखने के लिए दबाव 200; हीट 510 (रैंप टेस्ट 480), पुल 90, वेग 140, टाइम 125 और प्रेशर 200 माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के लिए।नोट: इष्टतम मापदंडों को व्यक्तिगत रूप से परिभाषित करने की आवश्यकता है क्योंकि आर्द्रता सहित कई कारक, माइक्रोपिपेट पुलर का मॉडल और ग्लास केशिकाएं इंजेक्शन पिपेट के आकार को प्रभावित कर सकती हैं। एक क्रमिक टेपर के साथ एक विस्तारित आकार के उद्देश्य से किया जाना चाहिए। पिपेट रखने की तैयारी एक माइक्रोफॉर्ज के लिए कदम 11.1 में तैयार एक खींचा केशिका सेट करें। फिलामेंट पर ग्लास मनका के ऊपर केशिका रखें और फिलामेंट को गर्म करते समय ग्लास मनका के साथ संपर्क बनाने के लिए केशिका को कम करें। कांच के मनका से हीटिंग और अलग करके केशिका को तोड़ें ताकि इसका बाहरी व्यास 60-100 माइक्रोन हो। फिलामेंट पर ग्लास मनका का सामना करने के लिए केशिका टिप को क्षैतिज रूप से रखें। केशिका टिप के आंतरिक व्यास को 10-20 माइक्रोन के व्यास तक पिघलने की अनुमति देने के लिए फिलामेंट को गर्म करें। केशिका को स्थानांतरित करें ताकि बिना संपर्क के केशिका टिप से एक बिंदु ~ 1 मिमी पर ग्लास मनका की स्थिति हो। केशिका को 20 डिग्री कोण पर झुकने की अनुमति देने के लिए फिलामेंट को गर्म करें। केशिका को डिस्माउंट करें, माइक्रोफॉर्ज से एक होल्डिंग पिपेट कहा जाता है।नोट: केशिका के आकार को मापने के लिए, माइक्रोफॉर्ज में एक आईपीस रेटिकल अधिमानतः स्थापित किया गया है। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की तैयारी एक माइक्रोफॉर्ज के लिए कदम 11.1 में तैयार एक खींचा केशिका सेट करें। फिलामेंट पर ग्लास मनका के ऊपर केशिका रखें और फिलामेंट को गर्म करते समय ग्लास मनका के साथ संपर्क बनाने के लिए केशिका को कम करें। केशिका को कांच के मनका से एक स्थिति में हीटिंग और अलग करके तोड़ें कि इसका बाहरी व्यास 6 माइक्रोन है। केशिका को स्थानांतरित करें ताकि बिना संपर्क के केशिका टिप से एक बिंदु ~ 1 मिमी पर ग्लास मनका की स्थिति हो। केशिका को 20 डिग्री कोण पर ऊपर की ओर झुकने की अनुमति देने के लिए फिलामेंट को गर्म करें। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को माइक्रोफॉर्ज से डिमाउंट करें और बाद में इस्तेमाल के लिए सुरक्षित बॉक्स में स्टोर करें।नोट: माइक्रोइंजेक्शन पिपेट निम्नलिखित विशिष्टताओं के साथ तैयार किए जाते हैं: बाहरी व्यास, 6 माइक्रोन; आंतरिक व्यास, 4.5-5 माइक्रोन; मोड़ कोण, 20 डिग्री। इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन की सफलता के लिए माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के इष्टतम डिजाइन को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है। बहुत बड़ा एक आंतरिक व्यास दाता DKO-phESCs (चर्चा अनुभाग देखें) के प्लाज्मा झिल्ली के टूटना को रोका जा सकता है । यदि आंतरिक व्यास बहुत संकीर्ण है, तो यह दाता DKO-phESCs के चिकनी पिपिंग में बाधा डाल सकता है। एक मोड़ कोण और लेफ्टिनेंट; 30 ° बेहतर है क्योंकि एक उच्च मोड़ कोण पीजो दालों के प्रभाव को बाधित करता है। 12. DKO-PHAESCs के इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन (चरण 12.2 से) से पहले, पीवीपी के 0.6 ग्राम वाली 50 एमएल ट्यूब में एम2 माध्यम के 5 एमएल जोड़कर और 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर ट्यूब को उत्तेजित करके एक पॉलीविनाइलपाइरोलिओलिडोन (पीवीपी) समाधान तैयार करें। पीवीपी पूरी तरह से भंग होने के बाद, समाधान बाँझ-फ़िल्टर किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के दिन, केसोम माध्यम के 900 माइक्रोन के साथ एक केंद्र-अच्छी डिश तैयार करें और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर डिश को प्री-वार्म करें। पीवीपी समाधान के 5 माइक्रोल की बूंदों और 10-सेमी डिश के ढक्कन पर एम2 माध्यम के 20 माइक्रोल को संरेखित करके माइक्रोमैनिपुलेशन डिश तैयार करें जो उल्टा रखा गया है। खनिज तेल के साथ बूंदों को कवर करें, और इंजेक्शन माइक्रोस्कोप के चरण पर पकवान रखें।नोट: माइक्रोमैनिमुलेशन डिश की अनुशंसित व्यवस्था चित्रा 4Bमें दिखाई गई है । माइक्रोमैनीपुलेटर पर एक होल्डिंग पिपेट स्थापित करें। माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करके फ्लोरोकार्बन तेल के साथ माइक्रोइंजेक्शन पिपेट भरें, और इसे पीजो एक्ट्यूएटर पर माउंट करें। पीवीपी समाधान के साथ एक बूंद में माइक्रोइंजेक्शन पिपेट विसर्जित करें और पीवीपी के साथ ग्लास को कोट करने और इसे कम चिपचिपा बनाने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट में पीवीपी समाधान की एक छोटी मात्रा लोड करें, और एम 2 माध्यम के साथ पिपेट को एक बूंद पर ले जाएं। M2 माध्यम में होल्डिंग पिपेट विसर्जित करें, और ड्रॉप के नीचे में पिपेट पर ध्यान केंद्रित करें। M2 मध्यम ड्रॉप में कदम 10.6 से DKO-phaESC निलंबन के लगभग 2 μL स्थानांतरण। एक मुंह पिपेट का उपयोग करके एक ही M2 मध्यम ड्रॉप में कदम 8.5 से 10 एमआई oocytes स्थानांतरित करें। इंजेक्शन के लिए, एम 2 मध्यम बूंद में एक ओसाइट घुमाएं ताकि पेरिविटेलिन स्पेस माइक्रोइंजेक्शन पिपेट का सामना कर सके, और एमआईआई प्लेट माइक्रोइंजेक्शन पिपेट(चित्रा 4A)के रास्ते में स्थित नहीं है। होल्डिंग पिपेट के माध्यम से नकारात्मक दबाव लागू करके ओसाइट पकड़ो।नोट: एक एमआईआई प्लेट नेत्रहीन ooplasm के एक फलाव के रूप में पहचाना जाता है जिसे “कूबड़” के रूप में जाना जाता है और अक्सर पहले ध्रुवीय शरीर के बगल में स्थित होता है। एमआईआई प्लेट में संलग्न गुणसूत्रों के साथ मेयोटिक स्पिंडल होता है। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट और एमआईआई प्लेट को छूने से बचा जाना चाहिए क्योंकि धुरी और गुणसूत्रों की यांत्रिक क्षति भ्रूण के विकास को बाधित कर सकती है। कोमल नकारात्मक दबाव लागू करके माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की नोक में एक DKO-phaESC लोड करें। एक अक्षुण्ण DKO-phaESC(चित्रा 3C;चर्चा देखें) के इंजेक्शन से बचने के लिए पाइपिंग द्वारा एक DKO-phaESC की प्लाज्मा झिल्ली टूटना ।नोट: यदि एक DKO-phaESC की प्लाज्मा झिल्ली पाइपिंग से उठी नहीं है, DKO-phaESC त्यागें और एक और DKO-phaESC लोड । माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को ओसाइट के जोना पेलुसिडा के संपर्क में रखें और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के भीतर थोड़ी मात्रा में निगेटिव प्रेशर लगाएं। पेरिविटेललाइन अंतरिक्ष की ओर माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की नोक को धक्का देते हुए जोना के माध्यम से तोड़ने के लिए पीजो आवेगों (तीव्रता, 20; आवृत्ति, 4) लागू करें। पुष्टि करें कि एमआईआई प्लेट, जिसमें एक धुरी और गुणसूत्र होते हैं, माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के रास्ते में स्थित नहीं है।नोट: अनुभवजन्य रूप से ज़ोना के माध्यम से ड्रिलिंग के लिए सबसे कम पीजो दालों के लिए सेटिंग को समायोजित करने के लिए oolemma को नुकसान की संभावना को कम करने के लिए । माइक्रोइंजेक्शन पिपेट से जोना पेलुसिडा के टुकड़े को त्यागें, और डीपीओ-phaESC को पिपेट के किनारे पर रखें। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के साथ ओसाइट को भेदें ताकि ऊलम्मा विपरीत दिशा में पहुंचे।नोट: धुरी और गुणसूत्रों को नुकसान से रोकने के लिए एमआईआई प्लेट को न छुएं। ऊलम्मा को छेदने के लिए एक पीजो पल्स (तीव्रता, 6; आवृत्ति, 1) लागू करें। सुनिश्चित करें कि oolemma माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के शाफ्ट के साथ आराम करता है।नोट: अनुभवजन्य रूप से ओसाइट को नुकसान को कम करने के लिए ऊलम्मा को तोड़ने के लिए पीजो पल्स की सबसे कम सेटिंग को परिभाषित करें। ओप्लास्म में मध्यम की न्यूनतम मात्रा के साथ DKO-phaESC इंजेक्ट करें, और ऊसाइट से माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को सुचारू रूप से वापस लें। होल्डिंग पिपेट से इंजेक्शन ओसाइट जारी करें, और इसे बाद में संग्रह के लिए माइक्रोड्रॉप के किनारे रखें। एम 2 मध्यम ड्रॉप में अन्य एमआईआई ओसाइट्स के लिए 12.9 से 12.17 तक इंजेक्शन प्रक्रिया दोहराएं।नोट: 20 मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेटर से बाहर oocytes रखने से बचें । हमारे अनुभव में, उचित प्रशिक्षण के बाद 15 मिनट के भीतर 10 ओसाइट्स के एक बैच को आराम से हेरफेर किया जा सकता है। M2 मध्यम ड्रॉप से इंजेक्शन ओसाइट्स के बैच को KSOM माध्यम के साथ एक पूर्व-गर्म केंद्र-अच्छी तरह से पकवान में स्थानांतरित करें। 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर1 घंटे के लिए पकवान रखें। पर्याप्त इंजेक्शन oocytes प्राप्त करने के लिए MII oocytes के अतिरिक्त समूहों के साथ कदम 12.5 और 12.20 से oocyte हेरफेर दोहराएं। 13. निर्मित अर्ध-क्लोन भ्रूण की सक्रियता केसोम माध्यम और सक्रियण माध्यम के प्रत्येक 900 μL के साथ दो केंद्र-अच्छी व्यंजन तैयार करें। प्रत्येक कुएं में केसोम माध्यम के 700 माइक्रोन के साथ एक 4-अच्छी प्लेट तैयार करें। 5% सीओ2 वातावरण में व्यंजन और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म करें। KSOM माध्यम में 1 घंटे के बाद, इंजेक्शन oocytes कदम 12.21 से पूर्व गरम केंद्र में अच्छी तरह से सक्रियण माध्यम के साथ अच्छी तरह से पकवान हस्तांतरण। एक्टिवेशन के लिए 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर6 घंटे के लिए डिश रखें। सक्रियण के बाद, कुछ अर्ध-क्लोन भ्रूण तीन ध्रुवीय निकायों का निरीक्षण करें, जो ओसाइट के पहले और दूसरे ध्रुवीय निकाय हैं, और DKO-phaESC(चित्रा 3E)से छद्म ध्रुवीय शरीर हैं। भ्रूण को 4-अच्छी प्लेट में केसोम माध्यम के साथ नए कुओं में स्थानांतरित करके 3 बार धोएं। केसोम माध्यम के साथ केंद्र-अच्छी डिश में भ्रूण स्थानांतरित करें, और आगे के विकास के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान रखें। 14. निर्मित अर्ध-क्लोन भ्रूण का विकास कदम 13.6 से KSOM माध्यम में संस्कृति के 1 दिन के बाद, कई अर्द्ध क्लोन भ्रूण 2 सेल चरण(चित्रा 5A)तक पहुंचने। विट्रो में प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण के आगे के विकास के लिए, 5% सीओ2 वायुमंडल में 37 डिग्री सेल्सियस पर केसोम माध्यम में अर्ध-क्लोन भ्रूण को तैयार करना जारी रखें। 2 दिन में ताजा KSOM माध्यम के लिए अर्द्ध क्लोन भ्रूण हस्तांतरण । 4 दिन में, कई भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट चरण(चित्रा 5A)तक पहुंच जाएंगे। अर्ध-क्लोन चूहों के व्युत्पन्न के लिए, 2-सेल भ्रूण को 14.1 चरण से छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ता महिलाओं के अंडाशय में स्थानांतरित करें। भ्रूण हस्तांतरण से एक दिन पहले पुरुषों को संभोग करके छद्म गर्भवती महिलाओं की पहचान करें और भ्रूण हस्तांतरण (0.5 दिन बाद कोइटम (डीपीसी)) के लिए दिन की सुबह में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले प्लग की उपस्थिति के आधार पर उनका चयन करें। लगभग 19.5 डीपीसी, पूर्ण अवधि के पिल्ले स्वाभाविक रूप से प्राप्तकर्ता महिलाओं(चित्रा 5B)से वितरित किए जाते हैं।