इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सी एलिगेंस जीनोम के निर्बाध CRISPR/Cas9 संपादन को इकट्ठे राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और स्क्रीनिंग के लिए डीपीवाई-10 सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करके सक्षम करना है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग सी एलिगेंस में विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक संशोधनों को करने के लिए किया जा सकता है जिसमें सम्मिलन, विलोपन, जीन प्रतिस्थापन और कोडन प्रतिस्थापन शामिल हैं।
जैविक रूप से प्रासंगिक महत्वपूर्ण समस्याओं का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट(CRISPR)/स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन्स CRISPR-संबद्ध प्रोटीन (कैस) प्रणाली का उपयोग किया गया है । CRISPR/कैस जीनोम संपादन विधि की अद्वितीय शक्ति शोधकर्ताओं को ठीक से उनके चयन के किसी भी लोकस को संपादित करने की अनुमति देता है, जिससे जीन समारोह की वृद्धि की समझ की सुविधा । CRISPR/Cas9 द्वारा सी एलिगेंस जीनोम के संपादन के लिए कई तरीकों को पहले वर्णित किया गया है । यहां, हम एक विधि पर चर्चा और प्रदर्शन करते हैं जो स्क्रीनिंग के लिए विट्रो असेंबल रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और डीपीवाई-10 सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करता है। विशेष रूप से, इस लेख में, हम CRISPR/Cas9 संपादन की इस विधि का उपयोग करते हुए होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू करने की चरण-दर-चरण प्रक्रिया से गुजरते हैं। इस अपेक्षाकृत सरल संपादन विधि का उपयोग ब्याज के किसी भी जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और दो सप्ताह से भी कम समय में CRISPR/Cas9 संपादन द्वारा होमोज़िगस-संपादित सी एलिगेंस की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है ।
क्लस्टर्ड नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (CRISPR)/स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन्स CRISPR-संबद्ध प्रोटीन (कैस) तकनीक जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में कुशल लक्षित जीनोम संपादन को सक्षम बनाता है1,2,3,4। CRISPR प्रणाली को सबसे पहले प्रोकैरियोटिक एंटीवायरल इम्यून रिस्पांस 5,6,7के हिस्से के रूप मेंखोजागया था । टाइप II CRISPR सिस्टम Cas9 जैसे एंडोक्यूलाइज का उपयोग करता है, एक ट्रांसएक्टिवेट आरएनए (ट्रेसर आरएनए) और एक छोटा, लक्ष्य डीएनए-विशिष्ट 20-न्यूक्लियोटाइड लॉन्ग गाइड CRISPR आरएनए (सीआरएनए) एक “एनजीजी” प्रोटोस्पेसर आसन्न मोटिफ (पाम) को पहचानने और लक्ष्य डीएनए5,6,7,8,9,10, 11,12में डबल-फंसे ब्रेक बनानेकेलिए। इस डबल फंसे ब्रेक को सेलुलर डीएनए मरम्मत मशीनरी द्वारा घाव के रूप में पहचाना जाता है। नतीजतन, उत्पन्न डबल-फंसे ब्रेक की मरम्मत दो रास्तों में से एक द्वारा की जा सकती है- i) गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) या ii) होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)13। NHEJ अक्सर त्रुटि प्रवण है और इसलिए, जब इस मार्ग का उपयोग लक्ष्य डीएनए में डबल-फंसे ब्रेक की मरम्मत के लिए किया जाता है, तो यह अक्सर ब्याज के जीन में निष्क्रिय उत्परिवर्तन (सम्मिलन, विलोपन) का कारण बनता है। दूसरी ओर, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के दोनों तरफ होमोलॉजी के साथ एक बहिर्जात मरम्मत टेम्पलेट की आपूर्ति करके, सेलुलर डीएनए मरम्मत मशीनरी को ब्रेक13की मरम्मत के लिए एचडीआर का उपयोग करने का निर्देश दिया जा सकता है। इस प्रकार एचडीआर विधि ब्याज के किसी भी लोकस के सटीक संपादन में सक्षम बनाती है।
सी एलिगेंस14 , 15 , 16 , 17 , 18,19,20के लिए विभिन्न प्रकार के CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रोटोकॉल का वर्णन किया गयाहै । सी एलिगेंस में सबसे अधिक नियोजित CRISPR/Cas9 संपादन विधियों में क्लोनिंग-आधारित और क्लोनिंग-मुक्त प्रोटोकॉल दोनों शामिल हैं ताकि CRISPR/Cas9 संपादन14, 15, 16,17,18,19,20के लिए मरम्मत टेम्पलेट उत्पन्न किया जा सके । इस प्रोटोकॉल में स्क्रीनिंग के लिए सह-CRISPR मार्कर के रूप में डीपीवाई-10 का उपयोग करने के आधार पर क्लोनिंग-मुक्त CRISPR/Cas9 संपादन प्रोटोकॉल पर विस्तार से चर्चा की गई है । अब तक, केवल विस्तृत सी elegans-CRISPRकेंद्रित/Cas9 संपादन वीडियो प्रोटोकॉल है कि मौजूद है21स्क्रीनिंग के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करता है । हालांकि, स्क्रीनिंग के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप तक पहुंच की आवश्यकता होती है, जिसे छोटे मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों (पीयूआई) में कई प्रयोगशालाओं तक पहुंचने में मुश्किल हो सकती है। यह ध्यान रखना उत्साहजनक है कि फ्लोरोसेंट मार्कर ले जाने वाले कीड़े और21,22के संपादन के बीच पिछले अध्ययनों में सकारात्मक सहसंबद्ध परिणाम प्राप्त हुए हैं । हालांकि, विभिन्न गाइड आरएनए और मरम्मत टेम्पलेट्स के साथ विभिन्न प्रकार की लोकी के संपादन के लिए फ्लोरेसेंस-आधारित स्क्रीनिंग विधि की समग्र दक्षता निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन आवश्यक हैं। अंत में, चूंकि इन फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए प्लाज्मिड्स एक्सट्राक्रोमोमोमल सरणी बनाते हैं, इसलिए इन सरणी से चर फ्लोरेसेंस का उत्पादन अक्सर होता है जो23की पहचान करना सकारात्मक बना सकता है। इसलिए, हालांकि फ्लोरेसेंस-आधारित स्क्रीनिंग विधि अपनाने के लिए उपयोगी हो सकती है, उपरोक्त मुद्दे इसकी प्रयोज्यता को सीमित कर सकते हैं।
एक सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करना जो एक दृश्यमान फेनोटाइप पैदा करता है, सकारात्मक रूप से संपादित कीड़ा 23,24, 25, 26,27,28कोखोजने के लिए जांच की आवश्यकता की उत्पन्नि की संख्या को बहुत कम करदेताहै। महत्वपूर्ण बात यह है कि इन मार्कर द्वारा उत्पादित फेनोटाइप को आसानी से एक साधारण विच्छेदन माइक्रोस्कोप 23 , 24 ,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34के तहत आसानी से पता लगाया जासकताहै । dpy-10 सह-CRISPR मार्कर सी एलिगेंस CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन24, 27प्रदर्शन के लिए सबसे अच्छा विशेषता और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सह CRISPR मार्कर में से एकहै । इसलिए, यह लेख सी एलिगेंस में CRISPR/Cas9 संपादन करने की विधि पर चर्चा करेगा, जिसमें एक सह-CRISPR मार्कर27,35के रूप में डीबीवाई-10 के साथ राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की सीधी डिलीवरी का उपयोग किया गया है। इस विधि में, तैयार संपादन इंजेक्शन मिश्रण में एक अच्छी तरह से विशेषता वाले डीपीवाई-10 सीआरआरएनए और डीपीवाई-10 मरम्मत टेम्पलेट होते हैं जो एक अवलोकन प्रमुख “रोलर” (रोल) फेनोटाइप की पीढ़ी में मध्यस्थता करते हैं जो डीपीवाई-10 जीन24,27, 29के भीतर एक ज्ञात विषम डीपीवाई-10 (cn64) उत्परिवर्तन द्वारा प्रदान किया जाता है। अपनी समरूप अवस्था में मौजूद होने पर, डीपीवाई-10 (cn64) उत्परिवर्तन एक डंपी (डीपीवाई) फेनोटाइप का कारण बनता है जो छोटे और स्टोयूटर कीड़े24,29का उत्पादन करता है। रोल फेनोटाइप को एचडीआर-मध्यस्थता CRISPR/Cas9 संपादन द्वारा dpy-10 जीन की एक प्रति में सह-आपूर्ति की गई डीपीवाई-10 मरम्मत टेम्पलेट के सटीक सम्मिलन द्वारा मध्यस्थता की जाती है । इसलिए, रोल सी एलिगेंस की उपस्थिति इंजेक्शन की कोशिकाओं के भीतर एक सफल एचडीआर-मध्यस्थता संपादन घटना को इंगित करती है। चूंकि सीआरआरएनए और ब्याज के लक्षित जीन का मरम्मत टेम्पलेट डीपीवाई-10 सीआरआरएनए और डीपीवाई-10 मरम्मत टेम्पलेट के साथ एक ही इंजेक्शन मिश्रण में हैं, इसलिए एक अच्छा मौका है कि पहचाने गए रोल कीड़े भी एक साथ ब्याज के लक्षित जीन पर संपादित किए गए थे। इसलिए, इन रोल कीड़े तो पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) (५० बीपी से अधिक संपादन के लिए) या पीसीआर द्वारा प्रतिबंध पाचन (५० बीपी से कम संपादन के लिए) के रूप में तकनीकों द्वारा ब्याज के संपादन के लिए जांच कर रहे हैं ।
जीनोम संपादन के लिए इस विधि का उपयोग करने के फायदे हैं: i) CRISPR संपादन अपेक्षाकृत उच्च दक्षता (2% से 70%) इस विधि का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है27; ii) इस विधि में उपयोग किए जाने वाले मरम्मत टेम्पलेट्स और गाइड आरएनए में क्लोनिंग शामिल नहीं है, जिससे उनकी पीढ़ी के लिए आवश्यक समय कम हो जाता है; iii) विट्रो मेंराइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों को कोडांतरण करके, इकट्ठे संपादन परिसरों की सांद्रता अपेक्षाकृत स्थिर बनाए रखी जा सकती है, जिससे प्रजनन क्षमता में सुधार होता है; iv) कुछ गाइड आरएनए जो प्लाज्मिड्स से व्यक्त किए जाने पर संपादन उत्पन्न करने में विफल रहते हैं, उन्हें 27 में विट्रो लिखित सीआरआरएएनए27के रूप में आपूर्ति किए जाने पर CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन के लिए काम करने के लिए दिखाया गया है; v) dpy-10 सह-CRISPR मार्कर सहित एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर आसान स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है और संतति की संख्या है कि सकारात्मक24, 27खोजने के लिए जांच की जानी चाहिए कम होजातीहै; और vi) डीएनए अनुक्रमण सत्यापित होमोज़िजियस-संपादित कृमि लाइनों कुछ हफ़्ते के भीतर इस विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है19,27.
कई अलग –अलग सी एलिगेंस क्रिस्पआर विधियों से संबंधित उत्कृष्ट पुस्तक अध्याय 14 ,15,16,17,18,19,20,43प्रकाशित किए गए हैं । हालांकि, एक प्रयोगशाला सेटिंग में एक वीडियो प्रारूप में DPY-10 सह CRISPR विधि के प्रदर्शन वर्तमान में कमी है । इस लेख में, हम आरबीएम-3.2 नामक प्रतिनिधि लक्ष्य जीन को संपादित करने के लिए डीपीवाई-10 सह-CRISPR विधि का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं, जो एक ख्यात आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (वर्मबेस: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10)है। विशेष रूप से, यहां हम विस्तार से सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 जीन के भीतर तीन समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू करने की विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें विट्रो इकट्ठे रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और एक एक्सोजेनोसली आपूर्ति किए गए रैखिक एकल-फंसे मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग किया जाता है। ये अध्ययन आरबीएम-3.2 जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन के साथ पहले सी एलिगेंस क्रिस्पआर स्ट्रेन पैदा करने में सफल रहे हैं। चूंकि वर्तमान में सी एलिगेंस में इस जीन के कार्य के बारे में बहुत कुछ नहीं जाना जाता है, इसलिए यह तनाव आरएमबी-3.2 के कार्य को विच्छेदन करने में एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम करेगा। सी एलिगेंस जीनोम के भीतर किसी भी लोकस पर सम्मिलन, प्रतिस्थापन और विलोपन बनाने के लिए भी इस विधि को अपनाया जा सकता है।
हमने आरबीएम-3.2 के अलावा कई जीन को संपादित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। विभिन्न लोकी, गाइड आरएनए और मरम्मत टेम्पलेट्स (एकल-फंसे और डबल-फंसे) के लिए हमारी संपादन क्षमता 2% और 58% (डेटा नहीं दिखाए गए) के बीच भिन्न है। मनाया संपादन क्षमता इस प्रोटोकॉल27के लिए 2% से 70% की पहले से सूचित संपादन क्षमता के बराबर हैं। हम जीन विलोपन बनाने में भी इस तकनीक का इस्तेमाल करने में सफल रहे हैं । दो crRNAs का उपयोग करके हमने एक जीन को बदल दिया जो हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) (डेटा नहीं दिखाए गए) के लिए कोडिंग अनुक्रम के साथ लंबाई में 6 केबी के करीब है। इस प्रयोग के लिए, विश्लेषण किए गए रोल एफ 1 कीड़े के बारे में14% जीएफपी (डेटा नहीं दिखाए गए) के साथ जीन विलोपन और प्रतिस्थापन के लिए सकारात्मक पाए गए। हालांकि, इस तकनीक का उपयोग करके किए जा सकने वाले जीन विलोपन और प्रतिस्थापन की अधिकतम लंबाई निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता होती है।
इस तकनीक का उपयोग उन प्रविष्टियों को बनाने के लिए किया जा सकता है जो 19 लंबाई में लगभग1.6किलो हैं। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके लंबाई में 1.6 केबी से अधिक हैं, दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक उत्पन्न करने और लंबे समय तक होमोलॉजी हथियारों के साथ मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग करने से डीएनए के बहुत बड़े टुकड़ों (~ 10 केबी)28के सम्मिलन को सक्षम किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस प्रोटोकॉल के साथ जीन संपादन के कई दौर बड़े संपादन उत्पन्न करने के लिए किए जा सकते हैं। अन्य प्लाज्मिड आधारित सी एलिगेंस CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रोटोकॉल भी CRISPR प्रयोगों के लिए अपनाया जा सकता है जिसमें १.६ केबी४६, ४७,४८से बड़े डीएनए टुकड़ों के सम्मिलन शामिल हैं ।
जीन संपादन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि ब्याज का जीन गुणसूत्र II पर डीपीवाई-10 लोकस से जुड़ा हुआ नहीं है। एक लक्ष्य जीन को डीपीवाई-10से जोड़ा जा रहा है, यह डीपीवाई-10 उत्परिवर्तन को आपके ब्याज के संपादन से दूर अलग करने के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है । इसलिए, इस घटना में कि ब्याज का जीन डीपीवाई-10 लोकस से जुड़ा हुआ है, अन्य सह-CRISPR मार्कर जैसे यूएनसी-58 (एक्स-क्रोमोसोम),अनसी-22 या जेन-4 (गुणसूत्रIV), और बेन-1 या पीएच-1 (गुणसूत्र III) जो विभिन्न गुणसूत्रों पर स्थितहैं,का उपयोग24,25, 26,28किया जा सकता है। मेयेर लैब के डेटा से पता चलता है कि बेन-1 और ज़ेन-4 म्यूटेशन को इस विधि28के साथ स्क्रीनिंग के लिए सफल सह-CRISPR मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सह-CRISPR मार्कर के रूप में ज़ेन-4 और पीएच-1 का उपयोग करने के लिए क्रमशः26,28गैर-जंगली प्रकार के ज़ेन-4 (cle10ts) या पीएच-1 (e2123ts) पृष्ठभूमि में CRISPR प्रयोग करने की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, बेन-1 जैसे कुछ सह-CRISPR मार्कर से जुड़े CRISPR प्रयोगों के लिए विशेष प्लेटों (जैसे बेंजिमिडाजोल युक्त प्लेटें)28की तैयारी की आवश्यकता हो सकती है। हमने इस विधि (डेटा नहीं दिखाए गए) का उपयोग करके डीपी-10 से जुड़े जीन के लिए सकारात्मक संपादन के लिए स्क्रीन करने के लिए यूएनसी-58 सह-CRISPR मार्कर का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। यूएनसी-58 (e665) उत्परिवर्तन एक दृश्यमान फेनोटाइप (पक्षाघात) प्रदान करता है जिसका प्रभावी रूप से सकारात्मक रूप से संपादित कीड़े24के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप तक पहुंच उपलब्ध है, तो फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए जीटीबीपी-1 जीन का उपयोग इस प्रोटोकॉल19के लिए सह-CRISPR मार्कर के रूप में भी किया जा सकता है।
जीनोम संपादन की इस विधि का उपयोग करते समय एक उच्च संपादन दक्षता के लिए, संपादन साइट Cas9 काटने साइट से 10 से 30 ठिकानों के भीतर होना चाहिए। यदि संपादन स्थल Cas9 कटिंग साइट से 30 से अधिक आधार दूर है, तो संपादन दक्षता19,35, 37से काफी कम होजातीहै। हालांकि, मेयेर लैब के एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि एक-दूसरे से दूरी पर दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक बनाने से इस प्रोटोकॉल28का उपयोग करके Cas9 कट साइट से दूर संपादन की प्रविष्टि को सक्षम किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, मरम्मत टेम्पलेट को डिजाइन किया गया था ताकि तीनों डाला गया स्टॉप कोडन एक ही रीडिंग फ्रेम में दिखाई दें। हालांकि, नल-म्यूटेंट बनाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति एक सार्वभौमिक ४३-कुर्सियां लंबी दस्तक में स्टॉप-इन कैसेट का उपयोग करना होगा जिसे पहले५०वर्णित किया गया है । महत्वपूर्ण बात, इस कैसेट सभी तीन संभव पढ़ने के फ्रेम में codons बंद कर दिया है और फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन का कारण बनता है । यह संपादित स्थल पर अनुचित या अपूर्ण मरम्मत होने पर शून्य-म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी रणनीति है।
अंत में, इसकी छोटी अवधि और इस विधि में हाल की प्रगति के कारण, यह नियमित प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट विधि है जिसमें लघु इम्यूनोजेनिक एपिटोप टैग, फ्लोरोसेंट टैग, जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन और कोडन प्रतिस्थापन शामिल हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को यूनिवर्सिटी ऑफ तुलसा (टीयू) स्टार्ट-अप फंड्स और टीयू फैकल्टी डेवलपमेंट समर फेलोशिप ने ज्योति अय्यर को सम्मानित किया । हम इस अध्ययन में शामिल छात्रों को वजीफे देने के लिए रसायन विज्ञान ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान कार्यक्रम (CSURP) और तुलसा स्नातक अनुसंधान चैलेंज (TURC) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम सुश्री कैरोलीन डन को उनकी तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । अंत में, हम डीआरएस जॉर्डन वार्ड, Aimee जारामिलो-लैम्बर्ट, अन्ना एलन, रॉबर्ट शेफ, विलियम पॉटर और सैली मोघे को इस पांडुलिपि पर उनकी आलोचनात्मक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।
Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
ECoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |