Målet med detta protokoll är att möjliggöra sömlös CRISPR/Cas9-redigering av C. elegans-genomet med hjälp av monterade ribonukleoproteinkomplex och dpy-10 co-CRISPR-markören för screening. Detta protokoll kan användas för att göra en mängd olika genetiska modifieringar i C. elegans inklusive infogningar, borttagningar, genersättningar och kodonersättning.
Det bakteriella clustered regelbundet Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associerade protein (Cas) system har utnyttjats av forskare för att studera viktiga biologiskt relevanta problem. Den oöverträffade kraften i CRISPR/Cas genomredigeringsmetod gör det möjligt för forskare att exakt redigera valfri locus, vilket underlättar en ökad förståelse för genfunktionen. Flera metoder för att redigera C. elegans genomet av CRISPR/Cas9 har beskrivits tidigare. Här diskuterar och demonstrerar vi en metod som använder in vitro-monterade ribonukleoproteinkomplex och dpy-10 co-CRISPR-markören för screening. Specifikt, i den här artikeln, går vi igenom steg-för-steg-processen att införa förtida stoppkodon i C. elegans rbm-3.2-genen genom homologistyrd reparation med denna metod för CRISPR / Cas9-redigering. Denna relativt enkla redigeringsmetod kan användas för att studera funktionen hos alla genrer av intresse och möjliggör generering av homozygous-redigerad C. elegans genom CRISPR / Cas9-redigering på mindre än två veckor.
Den klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningen (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associerade protein (Cas) -tekniken möjliggör effektiv riktad genomredigering i ett brett spektrum av organismer1,2,3,4. CRISPR-systemet upptäcktes först som en del av ett prokaryota antivirala immunsvar5,6,7. Typ II CRISPR-systemet använder en endonukleas som Cas9, ett transaktiverande RNA (tracrRNA) och ett kort, mål DNA-specifikt 20-nukleotid långt styr CRISPR RNA (crRNA) för att känna igen ett “NGG” Protospacer Adjacent Motif (PAM) och göra en dubbelsträngad paus i mål-DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Denna dubbelsträngade paus erkänns som en lesion av cellulära DNA reparation maskiner. Följaktligen kan den genererade dubbelsträngade pausen repareras av en av två vägar- i) Icke-homolog end joining (NHEJ) eller ii) Homology-riktad reparation (HDR)13. NHEJ är ofta felbenägen och därför, när denna väg används för att reparera den dubbelsträngade pausen i mål-DNA, orsakar det ofta inaktiverande mutationer (infogningar, borttagningar) i den gen som är av intresse. Å andra sidan, genom att förse en exogen reparationsmall med homologi till vardera sidan av dubbelsträngsbrottet, kan de cellulära DNA-reparationsmaskinerna riktas för att använda HDR för att reparera brott13. HDR-metoden möjliggör således exakt redigering av alla gräshoppor av intresse.
En mängd OLIKA CRISPR/ Cas9 genredigeringsprotokoll har beskrivits för C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De vanligaste CRISPR / Cas9 redigeringsmetoderna i C. elegans inkluderar både kloningsbaserade och kloningsfria protokoll för att generera reparationsmallar för CRISPR / Cas9-redigering14,15,16,17,18,19,20. Detta protokoll diskuterar i detalj ett kloningsfritt CRISPR / Cas9-redigeringsprotokoll baserat på att använda dpy-10 som en co-CRISPR-markör för screening. Hittills använder det enda detaljerade C. elegans-fokuseradeCRISPR / Cas9-redigeringsvideoprotokollet som finns en fluorescerande markör för screening21. Att använda en fluorescerande markör för screening kräver dock tillgång till ett fluorescensmikroskop, som många laboratorier vid små främst grundutbildningsinstitutioner (PUI) kan ha svårt att komma åt. Det är uppmuntrande att notera att positiva korrelativa resultat har erhållits i tidigare studier mellan maskar som bär fluorescerande markörer och närvaron avredigeringen 21,22. Ytterligare studier är dock nödvändiga för att fastställa den övergripande effektiviteten hos den fluorescensbaserade screeningmetoden för redigering av en mängd olika lokus med olika guide RNAs och reparationsmallar. Slutligen, eftersom plasmiderna kodning för dessa fluorescerande markörer bildar extrakroosommatriser, produceras variabel fluorescens ofta från dessa matriser som kan göra positiva svårt att identifiera23. Även om den fluorescensbaserade screeningmetoden kan vara användbar att anta, kan de ovannämnda frågorna därför begränsa dess tillämplighet.
Att använda en co-CRISPR-markör som producerar en synlig fenotyp minskar kraftigt antalet avkomma som måste screenas för att hitta en positivt redigerad mask23,24,25,26,27,28. Viktigt är att fenotyperna som produceras av dessa markörer lätt kan detekteras under ett enkelt dissekerande mikroskop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Dpy-10 co-CRISPR-markören är en av de bäst karakteriserade och allmänt använda co-CRISPR-markörerna för att utföra C. elegans CRISPR / Cas9 genomredigering24,27. Därför kommer den här artikeln att diskutera metoden att utföra CRISPR / Cas9-redigering i C. elegans med direkt leverans av ribonukleoproteinkomplex med dpy-10 som en co-CRISPR-markör27,35. I denna metod består den beredda redigering injektionsblandningen av en väl karakteriserad dpy-10 crRNA och dpy-10 reparation mall för att förmedla generationen av en observerbar dominerande “roller” (Rol) fenotyp som tilldelas av en känd heterozygous dpy-10 (cn64) mutation inom dpy-10 genen 24,27,29. När den finns i sitt homozygous tillstånd orsakar dpy-10(cn64) mutationen en dumpy (Dpy) fenotyp som producerar kortare och stouter maskar24,29. Rol fenotyp förmedlas av korrekt införande av den medföljande dpy-10 reparation mallen i en enda kopia av dpy-10 genen av HDR-medierad CRISPR /Cas9 redigering. Därför indikerar utseendet på Rol C. elegans en framgångsrik injektion samt en framgångsrik HDR-medierad redigeringshändelse i den injicerade maskens celler. Eftersom crRNA och reparationsmallen för målgenen av intresse är i samma injektionsblandning med dpy-10 crRNA och dpy-10 reparationsmall, finns det en god chans att de identifierade Rol maskarna också redigerades samtidigt vid målgenen av intresse. Därför screenas dessa Rol-maskar för redigering av intresse med tekniker som polymeraskedjereaktion (PCR) (för redigeringar större än 50 bp) eller av PCR följt av begränsningssammanfattning (för redigeringar mindre än 50 bp).
Fördelarna med att använda denna metod för genomredigering är: i) CRISPR-redigeringar kan genereras med en relativt hög effektivitet (2% till 70%) med denna metod27; ii) De reparationsmallar och riktlinje-RNAs som används i denna metod innebär inte kloning, vilket minskar den tid som krävs för deras generering. iii) Genom att montera ribonukleoproteinkomplex in vitrokan koncentrationerna i de monterade redigeringskomplexen bibehållas relativt konstant och därigenom förbättra reproducerbarheten. iv) vissa guide-RNAs som inte genererar redigeringar när de uttrycks från plasmider har visat sig fungera för CRISPR / Cas9 genomredigering när de levereras som in vitro transkriberade crRNAs27; v) inklusive dpy-10 co-CRISPR-markören möjliggör enkel screening med hjälp av ett dissekerande mikroskop och minskar antalet avkomma som måste screenas för att hitta positiva24,27; och vi) DNA-sekvensering verifierade homozygous-redigerade masklinjer kan erhållas med denna metod inom ett par veckor19,27.
Utmärkta bokkapitel som hänför sig till många olika C. elegans CRISPR-metoder har publicerats14,15,16,17,18,19,20,43. Demonstrationen av dpy-10 co-CRISPR-metoden i ett videoformat i laboratoriemiljö saknas dock för närvarande. I den här artikeln beskriver och demonstrerar vi processen att använda dpy-10 co-CRISPR-metoden för att redigera en representativ målgen som heter rbm-3.2, ett förmodat RNA-bindande protein (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Specifikt beskriver vi här i detalj metoden att införa tre för tidiga stoppkodoner inom C. elegans rbm-3.2 genen med hjälp av in vitro-monterade ribonukleoproteinkomplex och en exogent levererad linjär enkelsträngad reparationsmall. Dessa studier har lyckats generera den första C. elegans CRISPR-stammen med för tidiga stoppkodoner i rbm-3.2-genen. Eftersom inte mycket för närvarande är känt om funktionen hos denna gen i C. elegans, kommer denna stam att fungera som ett användbart verktyg för att dissekera funktionen av RMB-3.2. Denna metod kan också antas för att göra infogningar, substitutioner och borttagningar vid alla gräshoppor inom C. elegans genomet.
Vi har använt ovanstående protokoll för att redigera flera gener förutom rbm-3.2. Våra redigeringseffektiviteter för olika lokus, guide RNAs och reparationsmallar (enkelsträngade och dubbelsträngade) har varierat mellan 2% och 58% (data visas inte). De observerade redigeringseffektiviteterna är jämförbara med de tidigare rapporterade redigeringseffektiviteterna på 2% till 70% för detta protokoll27. Vi har också lyckats använda denna teknik för att göra genborttagningar. Med hjälp av två crRNAs ersatte vi en gen som är nära 6 kb lång med kodningssekvensen för grönt fluorescerande protein (GFP) (data som inte visas). För detta experiment befanns cirka 14% av de Rol F1-maskar som analyserades vara positiva för genborttagning och ersättning med GFP (data som inte visas). Ytterligare experiment krävs dock för att bestämma den maximala längden på genborttagningar och ersättningar som kan utföras med denna teknik.
Denna teknik kan användas för att göra infogningar som är ca 1,6 kb långa19. En ny studie har visat att för att göra infogningar som är över 1,6 kb långa med detta protokoll, generera två dubbelsträngsbrytningar och använda reparationsmallar med längre homologiarmar kan möjliggöra införandet av mycket större fragment av DNA (~ 10 Kb)28. Alternativt kan flera omgångar av genredigering med detta protokoll utföras för att generera större redigeringar. Andra plasmidbaserade C. elegans CRISPR/Cas9-genredigeringsprotokoll kan också antas för CRISPR-experiment som inbegriper införande av DNA-fragment större än 1,6 kb46,47,48.
Innan du använder detta protokoll för genredigering är det nödvändigt att säkerställa att genen av intresse inte är kopplad till dpy-10 locus på kromosom II. Om en målgen är kopplad till dpy-10kan det vara problematiskt att separera dpy-10-mutationen bort från din redigering av intresse. Därför, i händelse av att genen av intresse är kopplad till dpy-10 locus, Andra co-CRISPR-markörer såsom unc-58 (X-kromosom),unc-22 eller zen-4 (kromosom IV)och ben-1 eller pha-1 (kromosom III) som ligger på olika kromosomer får användas24,25,26,28. Data från Meyer lab visar att ben-1 och zen-4 mutationer kan användas som framgångsrika co-CRISPR markörer för screening med denna metod28. Det är dock viktigt att notera att användning av zen-4 och pha-1 som co-CRISPR-markörer kräver att CRISPR-experimentet i icke-vilda zen-4(cle10ts) respektive pha-1(e2123ts) bakgrunder26,28. Crispr-experiment med vissa co-CRISPR-markörer som ben-1 kan dessutom kräva beredning av specialplattor (t.ex. plattor som innehåller bensimidazol)28. Vi har framgångsrikt använt unc-58 co-CRISPR-markören för att screena för positiva redigeringar för en gen som är kopplad till dpy-10 med den här metoden (data visas inte). Unc-58(e665) mutationen ger en synlig fenotyp (förlamning) som effektivt kan användas för att screena för positivt redigerade maskar24. Alternativt, om tillgång till ett fluorescerande mikroskop finns tillgängligt, kan en fluorescerande märkt gtbp-1-gen också användas som co-CRISPR-markör för detta protokoll19.
För en hög redigeringseffektivitet när du använder den här metoden för genomredigering måste redigeringswebbplatsen vara inom 10 till 30 baser från Cas9-skärplatsen. Om redigeringswebbplatsen är över 30 baser bort från Cas9-skärplatsen sjunker redigeringseffektivitetendrastiskt 19,35,37. En ny studie från Meyer-labbet har dock visat att skapa två dubbelsträngsbrytningar på avstånd från varandra kan möjliggöra införandet av redigeringar långt borta från Cas9-skärplatsen med hjälp av detta protokoll28.
I det aktuella protokollet utformades reparationsmallen så att alla tre infogade stoppkodon visas i samma läsram. En alternativ strategi för att skapa null-mutanter skulle dock vara att använda en universell 43-baser lång knock-in STOP-IN kassett som har beskrivits tidigare50. Viktigt är att denna kassett har stoppkodon i alla de tre möjliga läsramarna och orsakar frameshift mutationer. Detta är en särskilt användbar strategi för att generera null-mutanter när felaktig eller ofullständig reparation sker på redigeringsplatsen.
Sammanfattningsvis, på grund av dess korta varaktighet och de senaste framstegen inom denna metod, är detta en utmärkt metod för rutinmässiga laboratorieexperiment som involverar tillsats av korta immunogena epitoptaggar, fluorescerande taggar, gör genborttagningar, genersättningar och kodonersättning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Start-up-medel från University of Tulsa (TU) och TU Faculty Development Summer Fellowship som tilldelades Jyoti Iyer. Vi vill tacka Kemisommaren Grundutbildningsprogrammet (CSURP) och Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) för att ha tilldelat stipendier till de studenter som deltar i denna studie. Vi vill tacka caroline Dunn för hennes tekniska hjälp. Slutligen vill vi tacka Drs. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter och Saili Moghe för deras kritiska kommentarer om detta manuskript.
Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
ECoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |