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Bioingegneria

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

Published: April 10, 2021
doi:
10.3791/62003
, , , , , , , ,
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, 2School of Engineering Medicine,Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering,Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

Abstract

신생 혈관화는 일반적으로 초기 단계에서 내피 세포 (EC)의 기존 정상 혈관 및 생체 역학 미세 환경에서 초기화되어 신생아 혈관화의 다음 과정으로부터 크게 다릅니다. 신생 혈관화의 다른 단계를 시뮬레이션하는 모델이 많이 있지만, 정상적인 혈관 미세 환경의 해당 자극하에서 신생 혈관화의 초기 과정을 항복하는 시험관 내 3D 모델은 여전히 부족합니다. 여기서 는 신생 혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방한 체외 3D 모델을 재구성했습니다. MIEN 모델에는 미세 유체 발아 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템이 포함되어 있습니다. 내피로 코팅된 기능적이고 난설성이 있는 마이크로채널이 형성되었고, 발아 공정은 미세유체 발아 칩에서 시뮬레이션되었다. 초기 생리학적 미세환경은 미세유체 조절 시스템으로 회수되었으며, 이 시스템은 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 경전혈, 다양한 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 분포에 동시에 노출될 것이다. MIEN 모델은 신생아 혈관화 메커니즘의 연구에 쉽게 적용 될 수 있으며 약물 선별 및 독성 응용 프로그램을위한 저렴한 플랫폼으로 잠재적 인 약속을 보유합니다.

Introduction

신생 혈관 화는성인,혈관 신생 및 동맥 발생5에서두 가지 주요 과정을 포함하는 많은 정상 및 병리학 적 과정1,2,3,4에서발생합니다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)6,기계적 자극, 특히 혈류 유도 전단 응력과 같은 가장 잘 알려진 성장 인자 외에, 신생혈관화7의 조절에 중요하다. 우리가 알다시피, 전단 응력의 크기와 형태는 혈관 세포의 다른 부분에서 극적으로 그리고 동적으로 변화하여 혈관 세포8,9,10,11,12에중요한 영향을 미칩니다. 이전 연구는 전단 스트레스가 세포 표현성 변화, 신호 변환, 유전자 발현 및 벽화 세포와의통신(13,14,16, 17,17,18,19,20)을포함한 EC의 다양한 측면에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 따라서, 신생 혈관화를 조절21,22,23,24.

따라서, 신생 혈관화를 더 잘 이해하기 위해, 시험관 내의자연 세포 미세 환경에서 공정을 재구성하는 것이 중요하다. 최근에는 마이크로선박을 만들고 미세한 조형 및 미세유체 기술의 발전을 활용하여마이크로환경 25,26,27을정밀하게 제어하기 위해 많은 모델이 설립되었습니다. 이들 모델에서, 마이크로용기는하이드로겔(28,29),폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체칩30,31, 32또는3D 바이오프린팅33,34에의해 생성될 수 있다. 발광 전단 응력(22,23,35,36,경전 유동37,38,39,40,혈관신생 인자41,42,균주/스트레치43,44, 45)및 다른 유형의세포32,46k와공동 배양등의 미세 환경의 일부 측면이 대조되었다. 일반적으로 대형 저수지 또는 주사기 펌프를 사용하여 퍼퓨즈 배지를 제공하였다. 이들 모델의 환원유량은 저수지와마이크로튜브(22,23,38,40)사이의 압력 강하에 의해 만들어졌다. 그러나 기계적 미세 환경은 이러한 방식으로 지속적으로 유지하기 어려웠습니다. 전단 응력이 높은 높은 유속이 관류에 사용되는 경우 Transendothelial 흐름이 증가하고 생리 수준을 초과할 것입니다. 이전 연구는 신생아 혈관화의 초기 기간에, 경피성 흐름의 속도는 일반적으로 0.05 μm/ s8이하의 그대로 있는 IC 및 지하 막 때문에 아주 낮다는 것을 보여주었습니다. 한편, 혈관 계통의 발광 전단 응력은 크게 다르지만 평균 값인 5-20 dyn/cm2,11,47로비교적 높다. 현재, 전작의 경피흐름의 속도는 일반적으로 0.5-15 μm/s22,38,39,40사이로 유지되었으며, 발광 전단 응력은 보통 10dyn/cm222미만이었다. 높은 발광 전단 스트레스와 생리학적 수준의 경내 흐름을 동시에 지속적으로 노출시키기가 어려운 대상으로 남아 있습니다. 

본 연구에서는, 우리는 신생 혈관화 (MIEN)의 초기 사건을 모방하는 시험관 내 3D 모델을 설명합니다. 우리는 관류 마이크로 튜브를 형성하고48발아과정을 시뮬레이션하기 위해 미세 유체 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템을 개발했습니다. MIEN 모델을 사용하면 신생 혈관화의 초기 기간에 자극된 EC의 미세 환경이 먼저 다시 회수됩니다. EC는 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 수준의 경위 흐름 및 다양한 VEGF 분포에 의해 동시에 자극될 수 있다. 우리는 MIEN 모델을 구체적으로 설정하는 단계와 다른 연구자에게 참조를 제공하기를 희망하여 주의를 기울여야 할 핵심 사항을 설명합니다.

Protocol

1. 웨이퍼 준비 참고: 이 프로토콜은 이 연구 중에 사용되는 SU-8 2075 네거티브 포토레지스트에 특이적입니다. 다음과 같이 스핀 코터에 메탄올과 이소프로파놀로 실리콘 웨이퍼를 3~5회 청소합니다: 첫 번째 스핀은 500rpm에서 15s, 그리고 3,000rpm에서 60s로 회전합니다. 실리콘 웨이퍼를 180°C로 예열된 핫플레이트로 옮기고 웨이퍼를 10분 동안 굽습니다. 핫플?…

Representative Results

여기에 제시된 신생혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방하는 시험관 내 3D 모델은 미세유체 발아 칩과 미세유체 제어 시스템으로 구성되었다. 미세유체 발아 칩은 이전 간행물22,23,37,40,51,52, 53에서최적화되었다. 간략?…

Discussion

오랜 시간 동안, 신생아의 실시간 관찰은 문제가되었습니다. 최근22, 32,40,46,54의발아을 위해 EC와 인접한 중전성 선박을 만들기 위해 여러 가지 접근법이 개발되었지만 기계적 미세 환경은 여전히 지속적으로 유지되기 어렵다. 높은 발광 전단 응력과 경도 유동의 낮은 속도를…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 중국 보조금 지원의 국립 자연 과학 연구 재단에 의해 지원되었다 (보조금 Nos. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 및 32071311), 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 (2016YFC101110101 및 2016YFC102202), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039)

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285
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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).
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