JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

نموذج microfluidic لتقليد الحدث الأولي من Neovascularization

Published: April 10, 2021
doi:
10.3791/62003
, , , , , , , ,
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, 2School of Engineering Medicine,Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering,Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

هنا، ونحن نقدم رقاقة microfluidic والتحكم فيها تلقائيا، ونظام microfluidic التداول عالية الكفاءة التي تلخص البيئة الدقيقة الأولية من neovascularization، مما يسمح الخلايا البطانية (ECs) ليتم تحفيزها من قبل ارتفاع الإجهاد القص الإنارة، والمستوى الفسيولوجي لتدفق عبر الغدد الصماء، ومختلف عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF) التوزيع في وقت واحد.

Abstract

عادة ما يتم تهيئة neovascularization من الأوعية الدموية الطبيعية الموجودة و البيئة الدقيقة الحيوية للخلايا البطانية (ECs) في المرحلة الأولية تختلف بشكل كبير من العملية التالية من neovascularization. على الرغم من أن هناك الكثير من النماذج لمحاكاة مراحل مختلفة من neovascularization، نموذج 3D في المختبر الذي يستسلم العملية الأولية من neovascularization تحت التحفيز المقابلة للأوعية الطبيعية microenvironments لا تزال تفتقر. هنا، قمنا بإعادة بناء نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر يحاكي الحدث الأولي للنيوفاكوسلارية (MIEN). نموذج MIEN يحتوي على رقاقة microfluidic تنبت والتحكم الآلي، ونظام تداول عالية الكفاءة. تم تشكيل قناة صغيرة وظيفية وقابلة للانحناء مغلفة بعمى الغدد الوثناء وتم محاكاة عملية النبتة في رقاقة البراعم الدقيقة. تم تلخيص البيئة الدقيقة الفسيولوجية في البداية من neovascularization مع نظام التحكم microfluidic ، والتي من شأنها أن تتعرض ECs إلى ارتفاع الإجهاد القص الإنارة ، والتدفق الفسيولوجي عبر الندوثيلي ، ومختلف توزيعات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF). ويمكن تطبيق نموذج MIEN بسهولة على دراسة آلية التشكل الذاتي ويحمل وعدا محتملا كمنصة منخفضة التكلفة لفحص الأدوية وتطبيقات السموم.

Introduction

يحدث النيوفاسكلارة في العديد من العمليات الطبيعية والمرضية1،2،3،4، والتي تشمل عمليتين رئيسيتين في البالغين ، تولد الأوعية الدموية وتولد الشرايين5. إلى جانب عوامل النمو الأكثر شهرة، مثل عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)6، التحفيز الميكانيكي ، ولا سيما تدفق الدم الناجم عن الإجهاد القص ، مهم في تنظيم neovascularization7. كما نعلم، فإن حجم وأشكال التوتر القص تختلف بشكل كبير وديناميكية في أجزاء مختلفة من الأوعية الدموية، مما أدى إلى آثار هامة على خلايا الأوعية الدموية8،9،10،11،12. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الإجهاد القص قد تؤثر على جوانب مختلفة من ECs, بما في ذلك التغيرات الظاهري الخلية, إشارة تحويل, التعبير الجيني, والتواصل مع الخلايا الجدارية13,14,15,16,17,18,19,20; ومن ثم، تنظيم neovascularization21،22،23،24.

ولذلك، لفهم أفضل neovascularization، من المهم إعادة بناء العملية في البيئة الدقيقة الخلوية الطبيعية في المختبر. في الآونة الأخيرة، وقد تم إنشاء العديد من النماذج لإنشاء الأوعية الدقيقة وتوفير مراقبة دقيقة للتقنية الدقيقة25،26،27، والاستفادة من التقدم في microfabrication والتكنولوجيا microfluidic. في هذه النماذج، يمكن أن تولد الأوعية الدقيقة من قبل hydrogel28،29، polydimethylsiloxane (PDMS) رقائق microfluidic30،31،32 أو 3D33،34. بعض جوانب البيئة الدقيقة، مثل الإجهاد القص اللمعان22,23,35,36, التدفق عبر الندخيل37,38,39,40, التدرج البيوكيميائي للعوامل الوعائية41,42, سلالة / تمتد43,44,45, وشارك في الثقافة مع أنواع أخرى من الخلايا32,46 وقد تم تقليدها والتحكم فيها. عادة، تم استخدام خزان كبير أو مضخة حقنة لتوفير المتوسطة المحقة. تم إنشاء التدفق عبر الندوهليلي في هذه النماذج عن طريق انخفاض الضغط بين الخزان و micro-أنبوب22،23،38،40. ومع ذلك ، كان من الصعب الحفاظ على البيئة الدقيقة الميكانيكية باستمرار بهذه الطريقة. سوف يزيد التدفق عبر الندندوهليلي ثم يتجاوز المستوى الفسيولوجي إذا تم استخدام معدل تدفق مرتفع مع إجهاد القص العالي للضخ. أظهرت الدراسة السابقة أنه في الفترة الأولية من النيوفاسكلارية ، فإن سرعة التدفق عبر الغدد الصمية منخفضة للغاية بسبب الغشاء ECs والغشاء السفلي السليم ، وعادة أقل من 0.05 ميكرومتر / س8. وفي الوقت نفسه، على الرغم من الإجهاد القص اللمعان في نظام الأوعية الدموية يختلف اختلافا كبيرا، فهي مرتفعة نسبيا مع متوسط القيم من 5-20 dyn/cm2،11،47. في الوقت الراهن ، تم الاحتفاظ بسرعة التدفق عبر الندوهل في الأعمال السابقة بشكل عام بين 0.5-15 ميكرومتر / س22،38،39،40، وكان الإجهاد القص اللمبوط عادة تحت 10 dyn/cm232. يبقى موضوعًا صعبًا لفضح ECs باستمرار لإجهاد القص العالي ومستوى الفيزيولوجي للتدفق عبر الندوئي في وقت واحد. 

في هذه الدراسة، ونحن وصف نموذج 3D في المختبر لمحاكاة الحدث الأولي من neovascularization (MIEN). قمنا بتطوير رقاقة microfluidic والسيطرة التلقائي، ونظام دوران عالية الكفاءة لتشكيل الأنابيب الدقيقة perfusion ومحاكاة عملية تنبت48. مع نموذج MIEN، يتم أولاً تلخيص البيئة الدقيقة من ECs حفز في الفترة الأولية من neovascularization. يمكن تحفيز ECs من خلال إجهاد القص اللمبّر العالي ، والمستوى الفسيولوجي للتدفق عبر الندوتيوفي وتوزيع VEGF المختلف في وقت واحد. نحن نصف خطوات إنشاء نموذج MIEN بالتفصيل والنقاط الرئيسية التي يجب الانتباه إليها ، على أمل توفير مرجع للباحثين الآخرين.

Protocol

1- إعداد الوافر ملاحظة: هذا البروتوكول محدد لـ SU-8 2075 الفوتراسرس السلبية المستخدمة أثناء هذا البحث. تنظيف رقاقة السيليكون 3 إلى 5 مرات مع الميثانول والإيزوبروبانول على معطف تدور على النحو التالي: تدور أولا لمدة 15 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم تدور لمدة 60 ثانية في 3000 دورة …

Representative Results

النموذج 3D في المختبر لمحاكاة الحدث الأولي من neovascularization (MIEN) المعروضة هنا تتكون من رقاقة تنبت microfluidic ونظام التحكم microfluidic. تم تحسين رقاقة الزرقة الزهية من المنشورات السابقة22،23،37،40،51،<sup class="…

Discussion

لفترة طويلة، كانت المراقبة في الوقت الحقيقي من neovascularization مشكلة. وقد تم مؤخرا وضع العديد من النهج لإنشاء بطانة الأوعية الم perfused مع ECs ومجاوبة لمصفوفة خارج الخلية لتنبت22،32،40،46،54، ولكن البيئة الدقيقة ا…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية لبحوث العلوم الطبيعية في الصين منح في المعونة (منحة رقمها 11827803، 31971244، 31570947، 11772036، 61533016، U20A20390 و 32071311)، البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (منحة رقم 2016YFC1101101 و 2016YFC102202)، ومشروع 111 (B13003)، ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (4194079).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial “vessels” for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Tags

Keywords: Microfluidic ModelNeovascularizationAngiogenesisEndothelial CellsVascular Endothelial Growth FactorHydrogelShear StressCell CultureFibronectinMicrofluidic Control SystemPerfusionSprouting
check_url/it/62003?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image