Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation
Summary
Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.
Abstract
Die Neovaskularisation wird in der Regel aus einer bestehenden normalen Vaskulatur initialisiert und die biomechanische Mikroumgebung von Endothelzellen (ECs) variiert in der Anfangsphase dramatisch vom folgenden Prozess der Neovaskularisation. Obwohl es viele Modelle gibt, um verschiedene Stadien der Neovaskularisation zu simulieren, fehlt noch ein In-vitro-3D-Modell, das den anfänglichen Prozess der Neovaskularisation unter den entsprechenden Stimulationen normaler Vaskulatur-Mikroumgebungen kapituliert. Hier haben wir ein In-vitro-3D-Modell rekonstruiert, das das ausgangse Ereignis der Neovaskularisation (MIEN) nachahmt. Das MIEN-Modell enthält einen mikrofluidischen Keimchip und ein automatisches, hocheffizientes Zirkulationssystem. Es wurde ein funktioneller, perfusabler Mikrokanal gebildet, der mit Endothel beschichtet ist, und der Prozess des Keimens wurde im mikrofluidischen Sprossenchip simuliert. Die ursprünglich physiologische Mikroumgebung der Neovaskularisation wurde mit dem mikrofluidischen Kontrollsystem rekapituliert, durch das ECs gleichzeitig hoher Luminalscherspannung, physiologischem transendothelialen Fluss und verschiedenen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Verteilungen (VEGF) ausgesetzt waren. Das MIEN-Modell kann problemlos auf die Untersuchung des Neovaskularisationsmechanismus angewendet werden und ist als kostengünstige Plattform für Arzneimittelscreenings und toxikologische Anwendungen ein potenzielles Versprechen.
Introduction
Neovaskularisation geschieht in vielen normalen und pathologischen Prozessen1,2,3,4, die zwei wichtige Prozesse bei Erwachsenen, Angiogenese und Arteriogenese5enthalten. Neben den bekanntesten Wachstumsfaktoren, wie dem vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF)6,sind mechanische Stimulationen, insbesondere der durchblutungsinduzierte Scherstress, bei der Regulierung der Neovaskularisation7wichtig. Wie wir wissen, variieren die Größe und Formen der Scherspannung dramatisch und dynamisch in verschiedenen Teilen der Vaskulatur, was zu wichtigen Auswirkungen auf die Gefäßzellen8,9,10,11,12führt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Scherspannung verschiedene Aspekte von ECs beeinflussen kann, einschließlich Zellphänotypische Veränderungen, Signaltransduktion, Genexpression und die Kommunikation mit Wandbildzellen13,14,15,16,17,18,19,20; daher die Neovaskularisation21,22,23,24regulieren.
Daher ist es wichtig, den Prozess in der natürlichen zellulären Mikroumgebung in vitrozu rekonstruieren, um die Neovaskularisation besser zu verstehen. In jüngster Zeit wurden viele Modelle zur Herstellung von Mikrogefäßen und zur präzisen Steuerung der Mikroumgebung25,26,27entwickelt, wobei die Fortschritte in der Mikrofertigung und der mikrofluidischen Technologie genutzt werden. In diesen Modellen können Mikrogefäße durch Hydrogel28,29, Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidische Chips30,31,32 oder 3D Bioprinting33,34erzeugt werden. Einige Aspekte der Mikroumgebung, wie Luminalscherspannung22,23,35,36, transendotheliale Durchfluss37,38,39,40, biochemischer Gradient der angiogenen Faktoren41,42, Stamm/Stretch43,44,45, und co-cultured mit anderen Arten von Zellen32,46 wurden nachgeahmt und kontrolliert. In der Regel wurde ein großes Reservoir oder eine Spritzenpumpe verwendet, um durchfundiertes Medium bereitzustellen. Transendothelfluss in diesen Modellen wurde durch Druckabfall zwischen dem Reservoir und Mikrorohr22,23,38,40. Die mechanische Mikroumgebung war jedoch auf diese Weise nur schwer konstant zu pflegen. Der transendotheliale Fluss würde zunehmen und dann das physiologische Niveau überschreiten, wenn eine hohe Durchflussrate mit hoher Scherspannung für die Perfusion verwendet würde. Frühere Studien zeigten, dass in der Anfangsphase der Neovaskularisation die Geschwindigkeit des transendotheliaalen Flusses aufgrund der intakten ECs und der Kellermembran, in der Regel unter 0,05 m/s8,sehr gering ist. Obwohl die Luminalscherspannung im Gefäßsystem stark variiert, ist sie mit Mittelwerten von 5-20 dyn/cm2,11,47relativ hoch. Vorerst wurde die Geschwindigkeit des transendothelialen Durchflusses in früheren Arbeiten in der Regel zwischen 0,5-15 ‘m/s22,38,39,40, gehalten und die Luminalscherspannung lag in der Regel unter 10 dyn/cm223. Es bleibt ein schwieriges Thema, ECs ständig einer hohen Luminalscherspannung und physiologischem Grad des transendothelialen Flusses gleichzeitig auszusetzen.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein In-vitro-3D-Modell, um das ausgangse Ereignis der Neovaskularisation (MIEN) nachzuahmen. Wir entwickelten einen mikrofluidischen Chip und ein automatisches Steuerungssystem, hocheffizientes Zirkulationssystem, um Perfusionsmikroröhrchen zu bilden und den Prozess des Keimens zu simulieren48. Mit dem MIEN-Modell wird zunächst die Mikroumgebung von ECs, die in der Anfangsphase der Neovaskularisation stimuliert wurden, rekapituliert. ECs können durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene VEGF-Verteilung gleichzeitig stimuliert werden. Wir beschreiben die Schritte zur Erstellung des MIEN-Modells im Detail und die wichtigsten Punkte, denen Aufmerksamkeit gewidmet werden muss, in der Hoffnung, eine Referenz für andere Forscher zu bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lange Zeit ist die Echtzeitbeobachtung der Neovaskularisation ein Problem. In letzter Zeit wurden mehrere Ansätze entwickelt, um durchlässige Gefäße zu erzeugen, die mit ECs auskleidung und an die extrazelluläre Matrix angrenzen, um22,32,40,46,54, aber die mechanische Mikroumgebung ist immer noch schwer zu pflegen. Es bleibt ein schwieriges Thema, die anf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (Grant-Nr. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 und 32071311), Nationales Forschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (Grant-Nr. 2016YFC1101101 und 2016YFC1102202), das 111-Projekt (B13003) und die Beijing Natural Science Foundation (4194079).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
| Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
| Image editing software | PhotoShop | NA | |
| Image processing program | ImageJ | NA | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
| Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
| Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
| Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
| Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
| Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
| Program software | MATLAB | NA | |
| Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
| Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
| SU-8 developer | Microchem | NA | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |
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