Modello microfluidico per imitare l'evento iniziale di neovascolarizzazione
Summary
Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).
Abstract
La neovascolarizzazione viene solitamente inizializzata da una vascolarizzazione normale esistente e il microambiente biomeccanico delle cellule endoteliali (EC) nella fase iniziale varia drammaticamente dal seguente processo di neovascolarizzazione. Sebbene ci siano molti modelli per simulare diversi stadi di neovascolarizzazione, manca ancora un modello 3D in vitro che capitola il processo iniziale di neovascolarizzazione sotto le corrispondenti stimolazioni dei normali microambientati vascolari. Qui, abbiamo ricostruito un modello 3D in vitro che imita l’evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN). Il modello MIEN contiene un chip di germinazione microfluidico e un sistema di controllo automatico e di circolazione altamente efficiente. Si è formato un microcanale funzionale e perfusabile rivestito di endotelio e il processo di germinazione è stato simulato nel chip di germinazione microfluidico. Il microambiente inizialmente fisiologico della neovascolarizzazione è stato riassunto con il sistema di controllo microfluidico, con il quale gli EC sarebbero stati esposti contemporaneamente ad elevate sollecitazioni di taglio luminare, flusso transendoteliale fisiologico e varie distribuzioni del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Il modello MIEN può essere prontamente applicato allo studio del meccanismo di neovascolarizzazione e mantiene una potenziale promessa come piattaforma a basso costo per lo screening dei farmaci e le applicazioni tossicologiche.
Introduction
La neovascolarizzazione avviene in molti processi normali e patologici1,2,3,4,che includono due processi principali negli adulti, angiogenesi e arteriogenesi5. Oltre ai più noti fattori di crescita, come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)6, le stimolazioni meccaniche, in particolare lo stress da taglio indotto dal flusso sanguigno, è importante nella regolazione della neovascolarizzazione7. Come sappiamo, la magnitudine e le forme di sollecitazione di taglio variano drammaticamente e dinamicamente in diverse parti della vascolarizzazione, con conseguenti effetti importanti sulle cellulevascolari 8,9,10,11,12. Studi precedenti hanno dimostrato che lo stress da taglio può influenzare vari aspetti degli EC, tra cui i cambiamenti fenotipici cellulari, la trasduzione del segnale, l’espressione genica e lacomunicazione con le cellule murali 13,14,15,16,17,18,19,20; quindi, regolare laneovascolarizzazione 21,22,23,24.
Pertanto, per comprendere meglio la neovascolarizzazione, è importante ricostruire il processo nel microambiente cellulare naturale in vitro. Recentemente, sono stati istituiti molti modelli per creare micro-vasi e fornire un controllo preciso del microambiente25,26,27, sfruttando i progressi della microfabbricazione e della tecnologia microfluidica. In questi modelli, i micro-vasi possono essere generati da idrogel28,29, polidimetilsiloxano (PDMS) chip microfluidici30,31,32 o 3D biostampa33,34. Alcuni aspetti del microambiente, come la sollecitazione di taglio luminale22,23,35,36, il flusso transendoteliale37,38,39,40,il gradiente biochimico dei fattori angiogenici41,42,ceppo/stiramento43,44,45e co-coltivato con altri tipi di cellule32,46 sono stati mimicked e controllati. Di solito, un grande serbatoio o pompa per siringhe è stato utilizzato per fornire mezzo perfuso. Il flusso transendoteliale in questi modelli è stato creato dalla caduta di pressione tra il serbatoio e ilmicrotubo 22,23,38,40. Tuttavia, il microambiente meccanico era difficile da mantenere costantemente in questo modo. Il flusso trasendoteliale aumenterebbe e quindi supererebbe il livello fisiologico se per la perfusione fosse utilizzata un’elevata portata con elevate sollecitazioni di taglio. Studi precedenti hanno dimostrato che nel periodo iniziale di neovascolarizzazione, la velocità del flusso transendoteliale è molto bassa a causa degli EC intatti e della membrana basale, di solito sotto 0,05 μm/s8. Nel frattempo, sebbene la sollecitazione di taglio luminare nel sistema vascolare vari notevolmente, è relativamente alta con valori medi di 5-20 dyn / cm2,11,47. Per ora, la velocità del flusso transendoteliale nei lavori precedenti è stata generalmente mantenuta tra 0,5-15 μm/s22,38,39,40e la sollecitazione di taglio luminale era solitamente inferiore a 10 dyn/cm223. Rimane un argomento difficile esporre costantemente gli EC ad un elevato stress da taglio luminare e a un livello fisiologico di flusso transendoteliale contemporaneamente.
Nel presente studio, descriviamo un modello 3D in vitro per imitare l’evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN). Abbiamo sviluppato un chip microfluidico e un sistema di controllo automatico, di circolazione altamente efficiente per formare micro-tubi perfusione e simulare il processo di germinazione48. Con il modello MIEN, il microambiente degli EC stimolato nel periodo iniziale di neovascolarizzazione viene in primo luogo riassunto. I CES possono essere stimolati da un elevato stress da taglio luminare, da un livello fisiologico di flusso transendoteliale e da varie distribuzioni VEGF contemporaneamente. Descriviamo in dettaglio le fasi di definizione del modello MIEN e i punti chiave a cui prestare attenzione, sperando di fornire un riferimento per altri ricercatori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per molto tempo, l’osservazione in tempo reale della neovascolarizzazione è stata un problema. Recentemente sono stati sviluppati diversi approcci per creare vasi perfusi che si allineano con EC e adiacenti alla matrice extracellulare per germogliare22,32,40,46,54, ma il microambiente meccanico è ancora difficile da mantenere costantemente. Rimane un argomen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant n. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 e 32071311), Programma nazionale chiave di ricerca e sviluppo della Cina (sovvenzioni n. 2016YFC1101101 e 2016YFC1102202), il progetto 111 (B13003) e la Beijing Natural Science Foundation (4194079).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
| Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
| Image editing software | PhotoShop | NA | |
| Image processing program | ImageJ | NA | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
| Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
| Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
| Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
| Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
| Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
| Program software | MATLAB | NA | |
| Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
| Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
| SU-8 developer | Microchem | NA | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |
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