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Bioingegneria

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

Published: April 10, 2021
doi:
10.3791/62003
, , , , , , , ,
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, 2School of Engineering Medicine,Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering,Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。

Abstract

新血管新生は、通常、既存の正常血管系から初期化され、初期段階における内皮細胞(ECs)の生体力学的微小環境は、次の新血管化の過程から劇的に変化する。新血管新生の異なる段階をシミュレートするモデルはたくさんありますが、正常な血管系微小環境の対応する刺激の下で新血管新生の初期プロセスをキャピテーションする in vitro 3Dモデルはまだ欠けています。ここでは、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣した インビトロ 3Dモデルを再構築しました。MIENモデルはマイクロ流体発芽の破片および自動制御、非常に能率的な循環システムを含んでいる。内皮でコーティングされた機能的で透過性のマイクロチャネルが形成され、マイクロ流体発芽チップで発芽のプロセスをシミュレートした。新血管形成の初期の生理学的微小環境は、マイクロ流体制御システムで再現され、それによって、ECは高い発光せん断応力、生理学的経皮流、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布に同時に曝露されるであろう。MIENモデルは新血管新生メカニズムの研究に容易に適用することができ、薬物スクリーニングおよび毒物学の適用のための低コストのプラットホームとして潜在的な約束を保持する。

Introduction

新血管新生は、成人における2つの主要なプロセス、血管新生および動脈新生5を含む多くの正常および病理学的プロセス1、2、3、4で起こる。血管内皮成長因子(VEGF)6のような最もよく知られた成長因子のほかに、機械的刺激、特に血流誘発せん断ストレスは、新血管新生7の調節において重要である。我々が知っているように、せん断応力の大きさと形態は脈管構造の異なる部分で劇的かつ動的に変化し、血管細胞8、9、10、11、12に重要な影響を及ぼす。これまでの研究では、せん断応力が、細胞表現型の変化、シグナル伝達、遺伝子発現、および壁画細胞13、14、15、16、17、18、19、20を含むECsの様々な側面に影響を及ぼす可能性があることを示している。したがって、新血管新血管化21、22、23、24を調節する。

したがって、新血管新生をよりよく理解するためには、自然細胞微小環境でのプロセスをvitroで再構築することが重要である。近年、マイクロ血管を作り、微細構造とマイクロ流体技術の進歩を生かして、マイクロ環境25、26、27を精密に制御するモデルが確立されています。これらのモデルでは、マイクロ血管は、ヒドロゲル28、29、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体チップ30、31、32または3Dバイオプリンティング33、34によって生成することができる。光性せん断応力22、23、35、36、経内皮流量37、38、39、40、血管新生因子41、42、株/ストレッチ43、44、45、および他のタイプの細胞との共培養など、微小環境のいくつかの側面が模倣および制御されている。通常、大きな貯留層またはシリンジポンプを用い、浸透媒体を提供した。これらのモデルの経皮流は、リザーバーとマイクロチューブ22、23、38、40の間の圧力降下によって作成された。しかし、機械的な微小環境は、このように絶えず維持するのが難しかった。高い剪断応力を伴う高い流量を灌流に使用すると、経年皮流の流れが増加し、その後生理学的レベルを超える。以前の研究では、新血管新生の初期の時期に、経内皮流の速度は、通常0.05 μm/s 8の下で、無傷のECと基部膜のために非常に低いことが示されました。一方、血管系における発光せん断応力は大きく異なりますが、5-20 dyn/cm2、11、47の平均値で比較的高い。今のところ、以前の作品における経皮流の速度は、一般的に0.5-15 μm/s22、38、39、40の間に保たれているが、発光せん断応力は通常10 dyn/cm223の下にあった。高い発光せん断応力と経経皮流の生理学的レベルに同時にICを常に曝露することは困難な対象です。 

本研究では、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣する in vitro 3Dモデルについて説明する。マイクロ流体チップと自動制御、高効率循環システムを開発し、灌流マイクロチューブを形成し、発芽プロセスをシミュレートしました。MIENモデルでは、新血管新生の初期に刺激されたICの微小環境が最初に再現される。高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々なVEGF分布によって同時に、ICを刺激することができます。MIENモデルを確立するステップと注意点を説明し、他の研究者への参考文献を提供することを期待しています。

Protocol

1. ウエハ準備 注:このプロトコルは、この研究で使用されるSU-8 2075陰性フォトレジストに固有のものです。 スピンコーターにメタノールとイソプロパノールを使用してシリコンウエハを3~5回洗浄します:最初に500rpmで15 sスピンし、3,000rpmで60s回転します。 シリコンウェーハをホットプレートに移し、180°Cに予熱し、ウエハを10分間焼きます。 ホット?…

Representative Results

ここで提示した新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣するin vitro 3Dモデルは、マイクロ流体発芽チップとマイクロ流体制御システムで構成されていました。マイクロ流体発芽チップは、以前の出版物22、23、37、40、51、52、53から最適化されました。<sup class="xref"…

Discussion

長い間、新生血管のリアルタイム観察が問題となっていた。最近では、22,32,40,46,54を発芽させるために、ICと並ぶ透過血管を作り出すアプローチが開発されていますが、機械的微小環境は常に維持するのが難しいです。高い光のせん断応力と経皮流の低速度を受けるICの?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国補助金援助の国立自然科学研究財団(助成金11827803、31971244、31570947、31570947、援助の国立自然科学研究財団によって支援されました。 11772036、61533016、U20A20390および32071311)、中国の国家主要研究開発プログラム(助成金2016YFC11011101および2016YFC1102202)、111プロジェクト(B13003)、自然科学4104(北京4104年)

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285
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Keywords: Microfluidic ModelNeovascularizationAngiogenesisEndothelial CellsVascular Endothelial Growth FactorHydrogelShear StressCell CultureFibronectinMicrofluidic Control SystemPerfusionSprouting
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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).
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