Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização
Summary
Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.
Abstract
A neovascularização é geralmente inicializada a partir de uma vasculatura normal existente e o microambiente biomecânico das células endoteliais (CES) no estágio inicial varia drasticamente do processo seguinte de neovascularização. Embora existam muitos modelos para simular diferentes estágios de neovascularização, ainda falta um modelo 3D in vitro que capitula o processo inicial de neovascularização sob as estimulações correspondentes de microambientes normais de vasculatura. Aqui, reconstruímos um modelo 3D in vitro que imita o evento inicial de neovascularização (MIEN). O modelo MIEN contém um chip de brotação microfluido e um sistema de circulação de controle automático e altamente eficiente. Formou-se um microcanal funcional e perfusível revestido de endotélio e o processo de broto foi simulado no chip de brotação microfluídica. O microambiente fisiológico inicialmente da neovascularização foi recapitulado com o sistema de controle microfluido, pelo qual as CEs seriam expostas ao alto estresse da cisalhamento luminal, fluxo transendotelial fisiológico e várias distribuições de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente. O modelo MIEN pode ser facilmente aplicado ao estudo do mecanismo de neovascularização e mantém uma potencial promessa como uma plataforma de baixo custo para aplicações de triagem de medicamentos e toxicologia.
Introduction
A neovascularização acontece em muitos processos normais e patológicos1,2,3,4, que incluem dois processos importantes em adultos, angiogênese e arteriogênese5. Além dos fatores de crescimento mais conhecidos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)6, estimulações mecânicas, em especial o estresse da cisalhamento induzido pelo fluxo sanguíneo, é importante na regulação da neovascularização7. Como sabemos, a magnitude e as formas de estresse de tesoura variam de forma dramática e dinâmica em diferentes partes da vasculatura, resultando em efeitos importantes sobre as células vasculares8,9,10,11,12. Estudos anteriores mostraram que o estresse da tesoura pode afetar vários aspectos das CE, incluindo alterações fenotípicas celulares, transdução de sinal, expressão genética e a comunicação com células mural13,14,15,16,17,18,19,20; portanto, regular a neovascularização21,22,23,24.
Portanto, para entender melhor a neovascularização, é importante reconstruir o processo no microambiente celular natural in vitro. Recentemente, muitos modelos foram estabelecidos para criar microestinas e fornecer controle preciso do microambiente25,26,27, aproveitando os avanços na microfabagem e tecnologia microfluida. Nesses modelos, os microimpostos podem ser gerados por chips microfluidos de hidrogel28,29, polidimtilsiloxano (PDMS)30,31,32 ou 3D bioimpressora33,34. Alguns aspectos do microambiente, tais como o estresse da cisalhamento luminal22,23,35,36, fluxo transendotelial37,38,39,40, gradiente bioquímico de fatores angiogênicos41,42, tensão/estiramento43,44,45, e co-cultivado com outros tipos de células32,46 foram imitados e controlados. Normalmente, um grande reservatório ou bomba de seringa era usado para fornecer meio perfumado. O fluxo transendotelial nesses modelos foi criado pela queda de pressão entre o reservatório e o micro-tubo22,23,38,40. No entanto, o microambiente mecânico era difícil de manter constantemente desta forma. O fluxo transendotelial aumentaria e, em seguida, excederia o nível fisiológico se uma alta taxa de fluxo com alto estresse de cisalhamento fosse usada para perfusão. Estudo anterior mostrou que, no período inicial de neovascularização, a velocidade do fluxo transendotelial é muito baixa devido às CEs intactas e membrana do porão, geralmente abaixo de 0,05 μm/s8. Enquanto isso, embora o estresse luminal do corte no sistema vascular varie muito, é relativamente alto com valores médios de 5-20 dyn/cm2,11,47. Por enquanto, a velocidade do fluxo transendotelial em trabalhos anteriores tem sido geralmente mantida entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, e o estresse da cisalhamento luminal foi geralmente inferior a 10 dyn/cm223. Continua sendo um assunto difícil de expor constantemente as CEs ao alto estresse luminal da cisalhamento e ao nível fisiológico do fluxo transendotelial simultaneamente.
No presente estudo, descrevemos um modelo 3D in vitro para imitar o evento inicial de neovascularização (MIEN). Desenvolvemos um chip microfluido e um sistema de circulação automático, altamente eficiente para formar micro-tubos de perfusão e simular o processo de brotaçãode 48. Com o modelo MIEN, o microambiente das CE estimulados no período inicial de neovascularização são, em primeiro lugar, recapitulados. As CE podem ser estimuladas pelo alto estresse luminal da cisalhamento, nível fisiológico de fluxo transendotelial e distribuição de vários VEGF simultaneamente. Descrevemos os passos de estabelecer o modelo MIEN em detalhes e os pontos-chave a serem prestados atenção, na esperança de fornecer uma referência para outros pesquisadores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Por muito tempo, a observação em tempo real da neovascularização tem sido um problema. Várias abordagens foram desenvolvidas recentemente para criar forro de vasos perfumados com CEs e adjacentes à matriz extracelular para brotar22,32,40,46,54, mas o microambiente mecânico ainda é difícil de manter constantemente. Continua sendo um sujeito difícil de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant nº 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 e 32071311), programa nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (grant nº 2016YFC110101 e 2016YFC1102202), o Projeto 111 (B13003) e a Fundação de Ciências Naturais de Pequim (4194079).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
| Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
| Image editing software | PhotoShop | NA | |
| Image processing program | ImageJ | NA | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
| Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
| Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
| Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
| Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
| Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
| Program software | MATLAB | NA | |
| Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
| Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
| SU-8 developer | Microchem | NA | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |
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