Микрофлюидная модель для имитации первоначального события неоваскуляризации
Summary
Здесь мы предоставляем микрофлюидный чип и автоматически контролируемую, высокоэффективную микрофлюидную систему циркуляции, которая рекапиталитирует начальную микроокноронизацию неоваскуляризации, позволяя эндотелиальным клеткам (ЭК) стимулироваться высоким люминесцентным стрессом, физиологическим уровнем трансендотелиального потока и различным сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) одновременно.
Abstract
Неоваскуляризация обычно инициализируется из существующей нормальной сосудоуположения, а биомеханическая микроокнония эндотелиальных клеток (ЭК) на начальном этапе резко отличается от следующего процесса неоваскуляризации. Хотя существует множество моделей для имитации различных стадий неоваскуляризации, 3D-модель in vitro, которая капитулирует первоначальный процесс неоваскуляризации при соответствующих стимуляциях нормальных микроокулинии сосудов, все еще отсутствует. Здесь мы реконструировали 3D-модель in vitro, которая имитирует начальное событие неоваскуляризации (MIEN). Модель MIEN содержит микрофлюидный прорастающий чип и автоматическую систему управления, высокоэффективную систему циркуляции. Сформировался функциональный, перфузируемый микроканал, покрытый эндотелием, и процесс прорастания был смоделирован в микрофлюидном прорастающих чипах. Первоначально физиологическая микроокнония неоваскуляризации была перепроверена с помощью системы микрофлюидного контроля, с помощью которой ЭК подвергались высокому светимому стрессу стрижки, физиологическому трансендохелиальный поток и различным сосудистым эндотелиальным факторам роста (VEGF) одновременно. Модель MIEN может быть легко применена к изучению механизма неоваскуляризации и имеет потенциальные перспективы в качестве недорогой платформы для скрининга лекарственных препаратов и применения токсикологии.
Introduction
Неоваскуляризация происходит во многих нормальных ипатологических процессов 1,2,3,4 , которые включают всебядва основных процесса у взрослых, ангиогенез иартериогенез 5. Помимо наиболее известных факторов роста, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) 6 ,механическаястимуляция, в частности, кровоток индуцированного стресса стрижки, имеет важное значение в регуляции неоваскуляризации7. Как известно, величина и формы стресса стрижки резко и динамично различаются в разных частях сосудов, что приводит к значительному воздействиюна сосудистые клетки 8,9,10,11,12. Предыдущие исследования показали, что стресс стрижки может повлиять на различные аспекты ЭК, в том числе клеточные фенотипические изменения, трансдукция сигнала, экспрессия генов, исвязь с фресками клетки 13,14,15,16,17,18,19,20; следовательно, регулировать неоваскуляризацию21,22,23,24.
Поэтому, чтобы лучше понять неоваскуляризацию, важно реконструировать процесс при естественной клеточной микрооквидеония in vitro. В последнее время было создано много моделей для создания микро-сосудов и обеспечения точного контроля микрооконденций25,26,27,пользуясь достижениями в области микрофабрикации и микрофлюидных технологий. В этих моделях, микро-сосуды могут бытьсозданы гидрогеля 28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) микрофлюидныхчипов 30,31,32 или 3Dбиопечати 33,34. Некоторые аспекты микроокантиронии, такие как светящийсястресс стрижки 22,23,35,36, трансендотельный поток37,38,39,40, биохимический градиентангиогенных факторов 41,42, штамм / растянуть43,44,45, и совместно культурных с другимитипами клеток 32,46 были имитированы и контролируются. Как правило, большой резервуар или шприц насос был использован для обеспечения perfused среды. Трансендотельный поток в этих моделях был создан падением давления междурезервуаром и микротрубой 22,23,38,40. Тем не менее, механическая микроокантиния было трудно поддерживать постоянно таким образом. Трансендотелиальный поток будет увеличиваться, а затем превышать физиологический уровень, если высокая скорость потока с высоким стрессом стрижки был использован для перфузии. Предыдущее исследование показало, что в начальный период неоваскуляризации, скорость трансендотелиального потока очень низка из-за нетронутых ЭК и мембраны подвала, как правило, под 0,05 мкм/с8. Между тем, хотя светимый стресс стрижки в сосудистой системе сильно варьируется, он относительно высок со средними значениями 5-20дин/см 2,11,47. На данный момент, скорость трансендотельного потока в предыдущих работах, как правило, хранится между 0,5-15 мкм /с 22,38,39,40, и светящийся блеск стресс, как правило, под 10 дин /см 223. По-прежнему трудно подвергать ЭК высокому светимому стрессу стрижки и физиологическому уровню трансендотельного потока одновременно.
В настоящем исследовании мы описываем 3D-модель in vitro, имитирующий начальное событие неоваскуляризации (MIEN). Мы разработали микрофлюидный чип и автоматическую систему управления, высокоэффективную систему циркуляции для формирования микротрубок перфузии и имитации процессапрорастания 48. С помощью модели MIEN микроокниронизация ЭК, стимулируемая в начальный период неоваскуляризации, в первую очередь резюмируется. ЭК можно стимулировать высоким светимым стрессом стрижки, физиологическим уровнем трансендотелиального потока и различным распределением VEGF одновременно. Мы подробно описываем шаги по созданию модели MIEN и ключевые моменты, на которые следует обратить внимание, надеясь предоставить рекомендации для других исследователей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Долгое время наблюдение за неоваскуляризацией в режиме реального времени было проблемой. Несколько подходов были разработаны в последнее время для создания перфлитированных сосудов накладки с ECs и прилегающих к внеклеточнойматрицы для прорастания 22,32<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом исследований естественных наук Китая Гранты в помощь (грант No 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 и 32071311), Национальная ключевая программа исследований и разработок Китая (грант No 2016YFC1101101 и 2016YFC1102202), проект 111 (B13003) и Пекинский фонд естественных наук (4194079).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
| Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
| Image editing software | PhotoShop | NA | |
| Image processing program | ImageJ | NA | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
| Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
| Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
| Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
| Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
| Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
| Program software | MATLAB | NA | |
| Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
| Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
| SU-8 developer | Microchem | NA | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |
Riferimenti
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
- Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
- Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
- Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
- Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
- Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
- Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
- Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
- Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
- Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
- Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
- Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
- Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
- Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
- Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
- Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
- Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
- Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
- Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
- Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
- Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
- Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
- Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
- Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
- Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
- Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
- Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
- Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
- Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
- Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
- Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
- Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial “vessels” for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
- Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
- Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
- Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
- Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
- Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), 188 (1987).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
- Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
- Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
- Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
- Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).
