Mikrofluidisk modell för att efterlikna inledande händelse av neovaskularisering

Summary

Här tillhandahåller vi ett mikrofluidiskt chip och ett automatiskt kontrollerat, högeffektivt cirkulationsmikrofluidiskt system som rekapitulerar den ursprungliga mikromiljön av neovaskularisering, vilket gör att endotelceller (ECs) kan stimuleras av hög luminal shearstress, fysiologisk nivå av transendotelflöde och olika vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) distribution samtidigt.

Abstract

Neovascularization initieras vanligtvis från en befintlig normal vaskulatur och biomekaniska microenvironment av endotelceller (ECs) i det inledande skedet varierar dramatiskt från följande process av neovascularization. Även om det finns gott om modeller för att simulera olika stadier av neovaskularisering, saknas fortfarande en in vitro 3D-modell som kapitulerar den ursprungliga processen för neovaskularisering under motsvarande stimuleringar av normala vaskulaturmikrovironment. Här rekonstruerade vi en in vitro 3D-modell som efterliknar den första händelsen av neovaskularisering (MIEN). MIEN-modellen innehåller ett mikrofluidiskt spirande chip och ett automatiskt styrsystem med hög effektiv cirkulation. En funktionell, perfusable microchannel belagda med endotel bildades och processen att spira simulerades i mikrofluidic spirande chip. Den ursprungligen fysiologiska mikromiljön av neovascularization recapitulated med det mikrofluidiska kontrollsystemet, genom vilket ECs skulle utsättas för hög luminal shear stress, fysiologiska transendotelial flöde och olika vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) distributioner samtidigt. MIEN-modellen kan enkelt tillämpas på studier av neovaskulariseringsmekanism och har ett potentiellt löfte som en billig plattform för läkemedelsscreening och toxikologiska tillämpningar.

Introduction

Neovascularization händer i många normala och patologiska processer^1,2,3,4, som inkluderar två stora processer hos vuxna, angiogenes och arteriogenesis⁵. Förutom de mest kända tillväxtfaktorerna, såsom vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)⁶, mekaniska stimuleringar, i synnerhet blodflödet inducerad savspänning, är viktigt vid regleringen av neovaskularisering⁷. Som vi vet varierar omfattningen och formerna av saxstress dramatiskt och dynamiskt i olika delar av vaskulaturen, vilket resulterar i viktiga effekter på^{kärlceller 8,9,10,11,12}. Tidigare studier har visat att shear stress kan påverka olika aspekter av ECs, inklusive cell fenotypiska förändringar, signaltransduktion, genuttryck, och kommunikationen med muralceller^{13,14,15,16,17,18,19,20}; därför reglera neovaskularisering^21,22,23,24.

För att bättre förstå neovaskularisering är det därför viktigt att rekonstruera processen i naturlig cellulär mikromiljö in vitro. Nyligen har många modeller etablerats för att skapa mikrokärl och ge exakt kontroll över mikromiljön^25,26,27, och dra nytta av framsteg inom mikrotillverkning och mikrofluidisk teknik. I dessa modeller kan mikrokärl genereras av hydrogel^28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) mikrofluidiska chips^30,31,32 eller 3D bioprinting^33,34. Vissa aspekter av mikromiljön, såsom luminal shear stress^22,23,35,36, transendotelial flöde^37,38,39,40, biokemisk gradient av angiogena faktorer^41,42, stam / sträcka^43,44,45, och samkulturerad med andra typer av celler^32,46 har efterliknats och kontrollerats. Vanligtvis användes en stor reservoar eller sprutpump för att ge perfused medium. Transendotelflödet i dessa modeller skapades av tryckfall mellan reservoaren och mikroröret^22,23,38,40. Den mekaniska mikromiljön var dock svår att upprätthålla hela tiden på detta sätt. Transendotelflödet skulle öka och sedan överstiga den fysiologiska nivån om ett högt flöde med hög savspänning användes för perfusion. Tidigare studie visade att vid den första perioden av neovaskularisering är hastigheten på transendotelflödet mycket låg på grund av de intakta ECs och källarmembranet, vanligtvis under 0,05 μm/s⁸. Under tiden, även om luminal shear stress i vaskulär systemet varierar kraftigt, är det relativt högt med medelvärden på 5-20 dyn/cm^2,11,47. För närvarande har hastigheten på transendotelflödet i tidigare verk i allmänhet hållits mellan 0,5-15 μm/s^22,38,39,40, och luminal shear stress var vanligtvis under 10 dyn / cm²²³. Det är fortfarande ett svårt ämne att ständigt utsätta ECs för hög luminal shear stress och fysiologisk nivå av transendotelial flöde samtidigt. 

I den aktuella studien beskriver vi en in vitro 3D-modell för att efterlikna den första händelsen av neovascularization (MIEN). Vi utvecklade ett mikrofluidiskt chip och ett automatiskt styrsystem, mycket effektivt cirkulationssystem för att bilda perfusionsmikrorör och simulera processen med att spira⁴⁸. Med MIEN-modellen rekapituleras först mikromiljön för ECs som stimulerades vid den första perioden av neovaskularisering. ECs kan stimuleras av hög luminal shear stress, fysiologisk nivå av transendotelial flöde och olika VEGF distribution samtidigt. Vi beskriver stegen för att etablera MIEN-modellen i detalj och de viktigaste punkterna som ska uppmärksammas, i hopp om att ge en referens till andra forskare.

Protocol

1. Wafer förberedelse OBS: Detta protokoll är specifikt för SU-8 2075 negativ fotoresist som används under denna forskning. Rengör silikonskivan 3 till 5 gånger med metanol och isopropanol på en spincoater enligt följande: snurra först i 15 s vid 500 varv/min och snurra sedan i 60 s vid 3 000 varv/min. Överför kiselskivan till en kokplatta, som är förvärmd till 180 °C och grädda skivan i 10 minuter. Ta bort kiselskivan från värmeplattan och kyl d…

Representative Results

In vitro 3D-modellen för att efterlikna den första händelsen av neovascularization (MIEN) som presenteras här bestod av ett mikrofluidiskt spirande chip och ett mikrofluidiskt kontrollsystem. Det mikrofluidiska groddarchipet optimerades från tidigare publikationer22,23,37,40,51,52,53…

Discussion

Under lång tid har realtidsobservation av neovaskularisering varit ett problem. Flera metoder har utvecklats nyligen för att skapa perfused fartyg foder med ECs och intill extracellulär matris för spirande^{22,32,40,46,54}, men den mekaniska mikromiljön är fortfarande svårt att upprätthålla ständigt. Det är fortfarande ett svårt ämne att efterlikna d…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Genview	GP3108
Collagen I, rat tail	Corning	354236
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Electromagnetic pinch valve	Wokun Technology	WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM)	Sciencell	1001
Fetal bovine serum (FBS)	Every Green	NA
Fibronectin	Corning	354008
FITC-dextran	Miragen	60842-46-8
Graphical programming environment	Lab VIEW	NA
Image editing software	PhotoShop	NA
Image processing program	ImageJ	NA
Isopropanol	Sigma-Aldrich	91237
Lithography equipment	Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences	URE-2000/35
Methanol	Sigma-Aldrich	82762
Micro-peristaltic pump	Lead Fluid	BT101L
Micro-syringe pump	Lead Fluid	TYD01
Oxygen plasma	MING HENG	PDC-MG
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS (10x)	Beyotime	ST448
Permanent epoxy negative photoresist	Microchem	SU-8 2075
Phenol Red sodium salt	Sigma-Aldrich	P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Polytetrafluoroethylene	Teflon	NA
Program software	MATLAB	NA
Recombinant Human VEGF-165	StemImmune LLC	HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	1.06498
Stage top incubator	Tokai Hit	NA
SU-8 developer	Microchem	NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P5285