نمذجة سرطان الثدي في أنسجة الثدي البشرية باستخدام نظام الفيزيولوجيا الدقيقة
Summary
يصف هذا البروتوكول بناء نظام في المختبر للفيزياء الدقيقة لدراسة سرطان الثدي باستخدام أنسجة الثدي البشرية الأولية مع مواد خارج الجرف.
Abstract
لا يزال سرطان الثدي (BC) سببا رئيسيا لوفاة النساء. على الرغم من استثمار أكثر من 700 مليون دولار في أبحاث BC سنويا ، فإن 97٪ من أدوية BC المرشحة تفشل في التجارب السريرية. لذلك ، هناك حاجة إلى نماذج جديدة لتحسين فهمنا للمرض. تم تطوير برنامج النظم الفيزيائية الدقيقة (MPS) التابع للمعهد القومي للصحة لتحسين الترجمة السريرية لاكتشافات العلوم الأساسية والاستراتيجيات العلاجية الجديدة الواعدة. هنا نقدم طريقة لتوليد MPS لسرطان الثدي (BC-MPS). هذا النموذج يتكيف مع نهج وصفها سابقا من زراعة الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية الأولية (WAT) عن طريق شطيرة وات بين أوراق الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC)ق. وتشمل الجوانب الجديدة من قبل الميلاد لدينا MPS بذر خلايا BC في أنسجة الثدي البشرية غير المريضة (HBT) التي تحتوي على مصفوفة خارج الخلية الأصلية، الخلايا الدهنية ناضجة، الخلايا الليفية المقيمة، والخلايا المناعية؛ وسند المزيج BC-HBT بين أوراق ASC المشتقة من HBT. الناتجة قبل الميلاد MPS مستقرة في الثقافة ex vivo لمدة 14 يوما على الأقل. يحتوي هذا النظام النموذجي على عناصر متعددة من البيئة الدقيقة التي تؤثر على BC بما في ذلك الخلايا الدهنية والخلايا النجمية والخلايا المناعية والمصفوفة خارج الخلية. وبالتالي يمكن استخدام BC-MPS لدراسة التفاعلات بين قبل الميلاد وضواحيها الدقيقة.
نحن نظهر مزايا BC-MPS لدينا من خلال دراسة اثنين من السلوكيات قبل الميلاد المعروفة للتأثير على تطور السرطان والانبثاث: 1) قبل الميلاد الحركة و 2) قبل الميلاد-HBT الأيضية الحديث. في حين سبق أن ثبت حركة BC باستخدام التصوير داخل الحتمية ، BC-MPS يسمح للتصوير الفاصل الزمني عالية الدقة باستخدام المجهر الفلوري على مدى عدة أيام. وعلاوة على ذلك، في حين تم عرض الحديث الأيضي سابقا باستخدام خلايا BC وخلايا مورين قبل الدهون المتمايزة إلى خلايا شحمية غير ناضجة، فإن نموذج BC-MPS لدينا هو أول نظام لإثبات هذا الكلام المتقاطع بين الخلايا الدهنية الثديية البشرية الأولية وخلايا BC في المختبر.
Introduction
كل عام، أكثر من 40،000 امرأة أمريكية تموت من سرطان الثدي (قبل الميلاد)1. على الرغم من أكثر من 700 مليون دولار استثمرت في البحوث قبل الميلاد سنويا، 97٪ من الأدوية قبل الميلاد مرشح تفشل التجارب السريرية2،3. هناك حاجة إلى نماذج جديدة لتحسين خط أنابيب تطوير الأدوية وفهمنا لإدراك BC. حدد برنامج المعاهد القومية للصحة الفيزيائية الدقيقة (MPS) الميزات المطلوبة لنماذج اختراق لتحسين ترجمة العلوم الأساسية إلى نجاح سريري4. وشملت هذه استخدام الخلايا البشرية الأولية أو الأنسجة، ومستقرة في الثقافة لمدة 4 أسابيع، وإدراج بنية الأنسجة الأصلية والاستجابة الفسيولوجية.
نماذج المختبر BC الحالية، مثل الثقافة ثنائية الأبعاد لخطوط خلايا BC، وإدراج الغشاء الثقافة المشتركة، والشفرات ثلاثية الأبعاد والأعضاء، لا تفي بمعايير MPS في المعاهد القومية للصحة لأن أيا من هذه إعادة رسملة العمارة أنسجة الثدي الأصلية. عندما تضاف مصفوفة خارج الخلية (ECM) إلى هذه الأنظمة، لا يتم استخدام ECM الثدي. بدلا من ذلك، يتم استخدام المواد الهلامية الكولاجين ومصفوفات غشاء الطابق السفلي.
الحالية في النظم الحية، مثل xenografts المريض المستمدة (PDX)، وبالمثل لا تفي بمعايير MPS المعاهد القومية للصحة لأن الأنسجة الثديية مورين تختلف اختلافا كبيرا عن الثديين البشري. وعلاوة على ذلك، يتم الاعتراف بشكل متزايد التفاعلات بين الجهاز المناعي قبل الميلاد كمفتاح في تطور الورم، ولكن نماذج المورين المناقصة المناعية المستخدمة لتوليد أورام PDX تفتقر إلى الخلايا التائية الناضجة، والخلايا B، والخلايا القاتلة الطبيعية. وعلاوة على ذلك، في حين يسمح PDX لأورام الثدي الأولية للحفاظ على وتوسيعها، يتم اختراق الأورام PDX الناتجة مع الخلايا سترومال مورين الأولية وECM5.
للتغلب على هذه التحديات، قمنا بتطوير رواية، فيفو، MPS الثدي البشري ثلاثي الأبعاد التي تلبي معايير MPS المعاهد القومية للصحة. يتم إنشاء أساس MPS الثدي لدينا عن طريق شطيرة أنسجة الثدي البشرية الأولية (HBT) بين ورقتين من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASCs)، معزولة أيضا عن HBT (الشكل 1). المكبس لنقل أوراق الخلية إلى شطيرة HBT يمكن أن تكون مطبوعة 3D أو مصنوعة من البلاستيك الاكريليك بسيطة (الشكل 1H، I). هذه التقنية تتكيف مع نهجنا الموصوف سابقا لزراعة الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية الأولية6،7. ويمكن بعد ذلك أن تكون المصنف MPS الثدي من قبل نموذج قبل الميلاد من الاختيار، بدءا من خطوط الخلية قبل الميلاد القياسية لأورام الثدي البشرية الأولية. هنا، نظهر أن هذه BC-MPS مستقرة في الثقافة لعدة أسابيع(الشكل 2)؛ وتشمل العناصر الأصلية من HBT مثل الخلايا الدهنية الثديية, ECM, بطانة الرحم, الخلايا المناعية (الشكل 3); وتلخيص التفاعلات الفسيولوجية بين قبل الميلاد وHBT مثل التحدث الأيضي(الشكل 4). وأخيرا، فإننا نظهر أن BC-MPS يسمح لدراسة حركة الأميبويد من خلايا BC في جميع أنحاء HBT (الشكل 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك حاجة إلى أنظمة جديدة لنمذجة سرطان الثدي البشري لتطوير فهم أفضل للمرض. تطوير النظم الفيزيائية الدقيقة البشرية لنمذجة إعدادات المرض التي تشمل ECM الأصلي والخلايا السترومية سيزيد من القوة التنبؤية للدراسات ما قبل السريرية. نموذج BC-MPS المعروض هنا هو نظام تم تطويره حديثا يتغلب على قيود الن…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر تولين تدفق قياس الخلايا وخلية الفرز الأساسية وكذلك تولين الأنسجة الأساسية لدعمهم التقني. تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الجنوبية الشرقية للجراحين التجميليين والترميميين 2019 منحة بحثية والمؤسسة الوطنية للعلوم (EPSCoR Track 2 RII، OIA 1632854).
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
Riferimenti
- DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
- . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
- Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
- Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
- Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
- Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
- Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
- Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
- Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
- Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Ricerca sul cancro. 71 (7), 2455-2465 (2011).
- Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
- Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
- Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
- Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
- Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
- Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
- Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
- Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
- Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
- Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
- Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).
