JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Published: April 23, 2021
doi:
10.3791/62009
, , , , , ,
1Department of Surgery,Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation,Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering,Louisiana State University, 5Department of Medicine,Tulane University School of Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Abstract

Borstkanker (BC) blijft een belangrijke doodsoorzaak voor vrouwen. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven. Daarom zijn nieuwe modellen nodig om ons begrip van de ziekte te verbeteren. Het NIH Microphysiological Systems (MPS) programma is ontwikkeld om de klinische vertaling van fundamentele wetenschappelijke ontdekkingen en veelbelovende nieuwe therapeutische strategieën te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het genereren van MPS voor borstkanker (BC-MPS). Dit model past een eerder beschreven benadering van het cultiveren van primair menselijk wit vetweefsel (WAT) aan door WAT tussen vet-afgeleide stamcelbladen (ASC)s te sandwichen. Nieuwe aspecten van onze BC-MPS zijn het zaaien van BC-cellen in niet-ziek menselijk borstweefsel (HBT) met inheemse extracellulaire matrix, volwassen adipocyten, ingezeten fibroblasten en immuuncellen; en het inklemmen van het BC-HBT-mengsel tussen HBT-afgeleide ASC-vellen. De resulterende BC-MPS is stabiel in cultuur ex vivo gedurende ten minste 14 dagen. Dit modelsysteem bevat meerdere elementen van het micromilieu die BC beïnvloeden, waaronder adipocyten, stromale cellen, immuuncellen en de extracellulaire matrix. Zo kan BC-MPS worden gebruikt om de interacties tussen BC en zijn micromilieu te bestuderen.

We tonen de voordelen van onze BC-MPS door twee BC-gedragingen te bestuderen waarvan bekend is dat ze de progressie en metastase van kanker beïnvloeden: 1) BC-beweeglijkheid en 2) BC-HBT metabolische overspraak. Hoewel bc-motiliteit eerder is aangetoond met behulp van intravitale beeldvorming, maakt BC-MPS time-lapse-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk met behulp van fluorescentiemicroscopie gedurende meerdere dagen. Bovendien, terwijl metabole overspraak eerder werd aangetoond met behulp van BC-cellen en muriene pre-adipocyten gedifferentieerd in onrijpe adipocyten, is ons BC-MPS-model het eerste systeem dat deze overspraak tussen primaire menselijke melkklieradipocyten en BC-cellen in vitro demonstreert.

Introduction

Elk jaar sterven meer dan 40.000 Amerikaanse vrouwen aan borstkanker (BC)1. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven2,3. Nieuwe modellen zijn nodig om de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en ons begrip van BC te verbeteren. Het NIH Microphysiological (MPS) Programma beschrijft de functies die nodig zijn voor baanbrekende modellen voor het verbeteren van de vertaling van basiswetenschap naar klinisch succes4. Deze omvatten het gebruik van primaire menselijke cellen of weefsels, stabiel in cultuur gedurende 4 weken, en opname van inheemse weefselarchitectuur en fysiologische respons.

Huidige in vitro BC-modellen, zoals tweedimensionale cultuur van BC-cellijnen, membraaninzetcocultuur en driedimensionale sferoïden en organoïden, voldoen niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat geen van deze de inheemse borstweefselarchitectuur samenvatten. Wanneer extracellulaire matrix (ECM) aan deze systemen wordt toegevoegd, wordt borst-ECM niet gebruikt; in plaats daarvan worden collageengels en keldermembraanmatrices gebruikt.

Huidige in vivo systemen, zoals patiënt afgeleide xenografts (PDX), voldoen ook niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat muriene borstweefsels enorm verschillen van menselijke borsten. Bovendien worden interacties tussen het immuunsysteem en BC steeds meer erkend als de sleutel in de ontwikkeling van tumoren, maar de immunocompromitteerde muriene modellen die worden gebruikt voor het genereren van PDX-tumoren missen volwassen T-cellen, B-cellen en natuurlijke killercellen. Bovendien, terwijl PDX het mogelijk maakt om primaire borsttumoren te behouden en uit te breiden, worden de resulterende PDX-tumoren geïnfiltreerd met primaire muriene stromale cellen en ECM5.

Om deze uitdagingen te overwinnen, hebben we een nieuwe, ex vivo, driedimensionale menselijke borst MPS ontwikkeld die voldoet aan de NIH MPS-criteria. De basis van onze borst MPS wordt gemaakt door sandwiching primaire menselijke borstweefsel (HBT) tussen twee vellen vet-afgeleide stamcellen (ASC’s), ook geïsoleerd van HBT (Figuur 1). Plunjers voor het overbrengen van de celbladen naar sandwich de HBT kan 3D-geprint of gemaakt van eenvoudige acryl kunststoffen(figuur 1H,I). Deze techniek past onze eerder beschreven aanpak aan voor het cultiveren van primair menselijk wit adipocytweefsel6,7. De borst MPS kan vervolgens worden gezaaid door een BC-model naar keuze, variërend van standaard BC-cellijnen tot primaire menselijke borsttumoren. Hier laten we zien dat deze BC-MPS meerdere weken stabiel in cultuur zijn (Figuur 2); omvatten inheemse elementen van HBT zoals melkklieradipocyten, ECM, endotheel, immuuncellen (figuur 3); en vat de fysiologische interacties tussen BC en HBT zoals metabole overspraak (figuur 4) samen. Ten slotte laten we zien dat BC-MPS de studie van amoebe beweging van BC-cellen in HBT mogelijk maakt (Figuur 5).

Protocol

Alle menselijke weefsels werden verzameld in overeenstemming met protocol #9189 zoals goedgekeurd door het Institutional Review Board Office van LSUHSC. 1. Zaaien van adipose-afgeleide stamcellen (ASC’s) voor celbladen Asc ‘s kopen uit commerciële bronnen of isoleren van primair menselijk borstweefsel door de vastgestelde protocollen8,9 te volgen. Zaad menselijke borst ASC’s bij 70% dichtheid (~80.000 cellen/cm2 o…

Representative Results

Stabiliteit in cultuurBC-MPS is een stabiel microfysiologisch systeem dat tot ten minste 14 dagen in vitro kan worden gekweekt. Een brightfield-afbeelding van de ASC-celbladen werd genomen bij 100x vergroting om het dwarsgestreepte patroon van het samenvloeiingsblad weer te geven (figuur 2A). De ASC-celbladen zijn minstens 4 weken stabiel in cultuur. BC-MPS op 14 dagen cultuur in een put van een 6 put plaat werd afgebeeld met een kleurenc…

Discussion

Nieuwe systemen voor het modelleren van menselijke borstkanker zijn nodig om een beter begrip van de ziekte te ontwikkelen. De ontwikkeling van menselijke microfysiologische systemen om ziekte-instellingen te modelleren die inheemse ECM- en stromale cellen omvatten, zal de voorspellende kracht van preklinische studies vergroten. Het HIER gepresenteerde BC-MPS-model is een nieuw ontwikkeld systeem dat de beperkingen van eerdere modellen overwint, waardoor BC in zijn oorspronkelijke HBT-omgeving kan worden geëvalueerd. Di…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen de Tulane Flow Cytometrie en Cell Sorting Core en de Tulane Histology Core bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant en de National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Ricerca sul cancro. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Breast CancerMicrophysiological SystemEx VivoAdipocytesImmune CellsVascular StructuresDuctal StructuresExtracellular MatrixPersonalized MedicinePharmaceutical DevelopmentTumor InitiationFibrosisExtracellular Matrix RemodelingGelatinPNIPAAmASCsPBSRazor BladeCancer Cell LinesBC-MPS Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image